引 言

近年来，随着干细胞研究的深入，利用干细胞移植治疗神经系统的疾病已成为积极探索的一种治疗手段。骨髓间充质干细胞 (bone marrow mesenchymal stem cells, MSCs) 作为一种成体干细胞，具有自我更新、高度增殖及在特定条件下多向分化的特性[1,2]。体外实验已经证实，MSCs 具有向神经干细胞 (neural stem cells，NSCs) 分化的潜能[3]。另一方面，MSCs 来源丰富，容易获取，并可自体移植，避免了伦理学和免疫抑制的问题[4]。因此，MSCs 移植修复中枢神经系统损伤和治疗疾病成为一个研究热点。菲立磁 (Feridex) 是经过美国食品及药物管理局(Food and Drug Administration, FDA)认可的临床上应用的核磁共振成像(magnetic resonance imaging, MRI)造影剂之一，作为移植细胞标记物，被广泛用于活体移植细胞的追踪[5]。本研究利用 Feridex 标记食蟹猴 MSCs，并自体脑内移植，采用无创伤性影像学技术在体示踪移植的 MSCs，同时通过普鲁士蓝染色和免疫组织化学染色观察骨髓基质细胞的迁移和分化情况。将影像学技术与神经形态学相结合，初步探讨MSCs 移植后的活体内示踪及其脑内存活、迁移和分化等情况。为 MSCs 应用于临床疾病的治疗提供技术参考。

材料与方法

材料

实验动物

实验动物包括 6 只健康成年雄性食蟹猴，由广西南宁灵康赛诺科生物科技有限公司提供，均按照国际 AAALAC 灵长类动物的标准饲养，动物病原体检疫和生物安全检验合格。

实验试剂

细胞培养试剂 DMEM、MSC-Qualified FBS、0.25%Trysin-EDTA、GlutaMAX、青链霉素及多聚赖氨酸均购自 Invitrogen 公司；Tenofovir 购自 LGM Pharmaceuticals 公司；Ficoll-PaqueTMPlus单核细胞分离液购自 StemCell 公司；碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF)购自R&D 公司；Feridex 购自 Sigma 公司；兔抗神经巢蛋白 (nestin) 抗体和小鼠抗单克隆神经元特异性烯醇化酶(NSE)抗体购自Chemicon 公司；小鼠抗 BrdU 抗体购自 Santa Cruz公司；FITC 标记的羊抗兔 IgG、FITC 标记的羊抗小鼠 IgG 和 Rhodamine 标记的兔抗小鼠IgG购自 Jackson 公司。

实验方法

食蟹猴MSCs培养

无菌条件下从食蟹猴髂骨嵴抽取5 ml 骨髓，加入等体积的 DPBS 稀释，贴壁缓慢加入盛有等体积 Ficoll 分离液的离心管内，2500 r/min 离心 20 min，小心吸取中间层细胞置于另一离心管中，PBS 洗涤 2 次，5×105/mL单核细胞种植在含有 10% FBS、1%青链霉素、1%GlutaMAX和 20 ng/mL bFGF 的 DMEM 低糖培养基上，5% CO2、37℃孵箱培养，24 h 后更换培养基，80%长满后，0.25%胰酶消化传代。

体外标记食蟹猴MSCs

体外培养的食蟹猴MSCs，加入 10 μmol/L BrdU，37℃、5% CO2下培育24 h。将掺入BrdU后的食蟹猴 MSCs 在不含有双抗的增殖培养基中培养 24 h，将 Feridex 和多聚赖氨酸混合，配制超顺磁铁颗粒工作液(100 μg/mL)，室温振荡器上混匀 1 h，吸出待标记细胞的全部原培养液，加入超顺磁铁颗粒工作液。37℃、5% CO2下培养24 h。

MRI检测

于细胞移植前1周和移植后 4 周 (n=6) 及移植后 8 周 (n=3) 分别行 MRI 检查。动物麻醉后俯卧位固定于猴 MRI 专用立体定位仪上，采用 GE 公司 1.5T MRI 行头颅横断面及冠状面平扫。横断面平扫基线为听眶线，冠状面平扫时基线垂直于听眶线。采用 SE 序列行T1W 及 T2W 成像。成像参数为：层厚 1.0 mm，层间距 1.0 mm，扫描持续约 20 min。为了确保动物在进行 MRI 扫描过程中不发生呕吐，MRI 扫描前 4 h 禁饮食。

脑内移植位点的确定

根据MRI 扫描图像确定细胞移植位点 (右侧纹状体、尾状核和黑质)。确定 MRI 图像中耳棒位置为零层面，根据移植细胞的纹状体层面，记录移植点距零层面的前后数据(X轴数据，Ap 值)，测量穿刺点距中线的距离，记录穿刺点左右的数据 (Z 轴数据，Lat 值) 和穿刺深度(Y轴数据，V 值)。移植位点具体数据见表 1。

脑内移植手术

手术前的准备包括备头皮、气管插管、使用阿托品 (0.02 mg/kg im) 减少分泌物，乙醚(2 mg/kg im)麻醉和静脉穿刺输液。手术时必须有心电监护，观察呼吸、心跳、血压和体温等生命体征。将立体定向仪调整校对归零，动物头部固定于脑立体定向仪。切开皮肤及皮下组织，暴露颅骨，根据脑立体定向仪的数据，确定在颅骨上的穿刺点位置，磨钻颅骨达骨膜。连接微量注射细胞悬液，注射速度 1.33 ml/min，注射完毕 10 min 后拔针。缝合伤口，动物清醒后，拔除插管，送回猴舍。观察动物的神志、呼吸、行动，直至其完全正常。

普鲁士蓝染色

将细胞或冰冻组织切片用 0.1 mol/L PB 洗一次，4% PFA 固定液 4℃固定 30 min，用纯水洗3次，每次 5 min。4%亚铁氰化钾溶液与 4%盐酸以 1∶1 比例混合摇匀，形成复合物A。将细胞或组织切片加入复合物 A，室温下反应 50 min，0.1 mol/L PB 洗两次，每次5 min，再加入 0.1 mol/L PB，光镜观察。

免疫荧光染色

标记细胞移植后 4 和 8 周，将动物安乐死，取脑组织固定，冰冻切片，片厚 30 μm，采用免疫荧光双标染色标记细胞，一抗为 BrdU 抗体、nestin 抗体和 NSE 抗体。根据一抗的动物来源，选用相应的罗丹明或异硫氰酸荧光素结合的IgG 进行免疫双标记，荧光显微镜观察脑片。

结 果

食蟹猴 MSCs 培养

倒置相差显微镜下，初接种的细胞呈圆球状，分散悬浮于培养液中；2～4 d后出现长梭形细胞，少部分细胞呈纺锤形或多角形，大小长短不一(图 1A)；4～6 d 出现增殖克隆，长梭形细胞呈涡旋状排列生长(图 1B)；培养 8～10 d 后，细胞 80%融合。

Feridex体外标记干细胞

Feridex标记后的食蟹猴 MSCs 呈淡黄色 (图 1C)，普鲁士蓝染色显示 90%以上的 MSCs细胞质内出现蓝色颗粒，围绕在细胞核周围(图 1D)，对照组的未标记细胞质内无蓝色颗粒。

MRI检测

术后 4 和 8 周行 MRI 检查。MRI 的 T1WI序列检测显示，与移植前的 MRI 图像比较(图 2A)，右侧 Feridex 标记的移植干细胞区域可见到明显的低信号改变 (图 2B)，低信号分别位于右侧纹状体、黑质和尾状核体部 (图 2C)。围绕低信号区域，周围可见一圈高信号，这是由移植细胞后局部组织的水肿、出血引起的，与移植 4 周后的 MRI 图像比较，移植 8周后的图像低信号区域略有缩小，周围高信号减少。左侧未移植标记细胞的区域无低信号改变。

组织学检查

普鲁士蓝染色结果显示，细胞移植后 4 周，移植细胞限于同侧大脑组织，右侧纹状体、黑质移植区域可见到许多细胞质呈蓝色的铁颗粒细胞，左侧未标记细胞侧为阴性反应。移植细胞在移植区域和注射针道周围聚集，并向周围迁移(图3A 和 3B)，少部分细胞自注射区域向周围分散迁移，可分辨出分散的单个细胞，形态多呈圆形胞体(图3B)，未见呈神经元样形态的细胞；另一方面，部分移植细胞通过血管在同侧脑实质内迁移(图3C)。移植后8 周，移植细胞向对侧脑区扩散迁移，单个散在分布于对侧纹状体 (图 3D)、黑质、尾状核和胼胝体等脑区，或围绕分布于血管周围，对侧海马未见迁移的移植细胞。免疫荧光染色结果显示，细胞移植后 8 周，BrdU 阳性细胞集中于移植区域内，未见 BrdU 和 NSE、BrdU和 nestin 双阳性移植细胞 (图 4)。

讨 论

中枢神经系统损伤后的再生修复问题一直是神经科学领域关注的重点之一。随着干细胞研究的不断深入，干细胞移植治疗拓宽了人类中枢神经系统损伤的治疗前景[6,7]。研究显示，MSCs 可以在适当条件下向神经干细胞、神经元和神经胶质细胞方向分化。另一方面，MSCs容易获取和体外大量扩增，同时可来源于自体，为临床移植治疗应用提供了无限制来源，避免了胎儿组织移植中存在的伦理和免疫排斥问题[8]。因此，MSCs 在移植治疗中枢神经系统疾病中具有广阔的应用前景[9,10]。体内外实验均证实，MSCs 移植能保护并促进损伤的神经系统功能恢复，但 MSCs 移植后在体内存活、分化、迁移及与宿主整合的情况并不明确。因此，寻找长期稳定的移植细胞标记物是干细胞移植研究的方向之一。好的干细胞标记物必须具备如下特征：既能活体检测移植细胞的迁移，同时也能用于动物处死后的病理组织检测，且标记物标记细胞不会造 成 移 植 细 胞 的 损 害 。 Feridex 是 经 过 美 国 FDA 认 可 的 一 种 超 顺 磁 性 氧 化 铁(superparamagneticiron oxide，SPIO)，是临床上经常应用的核磁共振对比剂之一。Feridex 是右旋糖酐超顺磁性氧化铁磁共振对比剂，其颗粒平均直径为 80 nm，核心氧化铁直径为20 nm，外周为葡萄糖包裹，理化性质稳定。临床上主要用于静脉注射来诊断肝肿瘤，近年发现也可以用来作为细胞活体标记的示踪剂[11,12]。本研究采用Feridex 标记食蟹猴骨髓 MSCs，通过非侵入性的 MRI 技术对脑内自体移植的 MSCs 进行活体定位和追踪，另一方面，通过组织学切片荧光双标技术研究移植后的MSCs 在脑内分布、迁移和分化的情况。MRI 影像学结果与组织学切片结果基本一致，但由于现阶段MRI分辨率的限制，MRI 图像并不能显示组织切片上观察到的细胞细小的迁移情况。组织切片染色结果显示，移植的 MSCs 可在脑内存活并迁移，移植 4 周后，MSCs 迁移局限于同侧脑区，8 周后可见对侧迁移。细胞形态以小圆形为主，并未发现神经细胞的形态改变，BrdU免疫双标结果也没有发现移植细胞表达神经前体细胞标志物 nestin 或神经元标志物 NSE。这个结果与之前的研究结果并不完全一致，可能原因包括实验动物种属差异、MSCs有无体外诱导分化过程等。脑内移植的 MSCs 能否分化成神经细胞、能否与宿主神经元建立突触联系，是一个值得深入研究的课题。

总之，在基础研究方面，有关干细胞移植治疗神经系统疾病的有效性已经取得共识，但是有关干细胞移植后的作用机制、细胞归宿等，还没有取得一致的结论。因此，干细胞移植入脑后的增殖、迁移和可控性分化调控及活体示踪问题，是细胞脑内移植研究的重点之一，也是干细胞用于中枢神经系统移植和替代治疗的关键所在。采用合适的非侵袭的手段在体识别、跟踪移植后干细胞的存活状态及其与宿主神经组织整合的情况，将提高干细胞移植疗法的学术价值。