本文作者:杨涛 梅文莉 曾艳波 左文健 戴好富 单位：海南大学园艺园林学院 中国热带农业科学院热带生物技术研究所 海南省黎药资源天然产物研究与利用重点实验室 海口市热带天然产物研究与利用重点实验室

酒饼簕[Atalantiabuxifolia(Poir.)Oliv.]，为芸香科(Rutaceae)酒饼簕属植物，在中国主要分布于海南、广东、广西和台湾等地[1]。国外主要分布于印度南部、孟加拉东部和斯里兰卡[2]。酒饼簕作为一种传统的药用植物，具有清热解表，化痰止咳，行气止痛之功效，民间用于治疗流感、咳嗽、疟疾和胃痛等[3]。植物化学研究表明，该植物的叶和根中含有不同类型的次生代谢产物。叶中报道的化学成分主要有挥发油[4–5]、香豆素[6]等，根中主要含有倍半萜[7]、吖啶酮生物碱[8–10]、四降三萜[11]类化合物。现代药理活性研究表明，叶的挥发油对细菌和某些致病性真菌具有较强的抑制作用[12]；根中的吖啶酮生物碱具有抑制EB病毒[13]和人类早幼粒细胞白血病细胞(HL-60)[14]增殖分化等多种生物活性；根中的四降三萜具有昆虫拒食活性[11]。为了从中寻找新的具有抗肿瘤活性的成分，我们对酒饼簕根乙醇提取物乙酸乙酯部分的化学成分及抗肿瘤活性进行研究，共分离鉴定了9个化合物(图1)，其中化合物1和8对人肝癌细胞(SMMC-7721)具有细胞毒活性，化合物3对慢性髓原白血病细胞(K562)的增殖显示了较强的生长抑制活性。本文报道这些化合物的分离纯化、结构鉴定以及细胞毒活性。1材料和方法

1.1材料试验材料酒饼簕根于2011年4月采自海南省海口市，并经中国热带农业科学院热带生物技术研究所代正福副研究员鉴定为芸香科酒饼簕属酒饼簕[Atalantiabuxifolia(Poir.)Oliv.]，凭证标本(AB201104)存放于中国热带农业科学院热带生物技术研究所。人肝癌细胞(SMMC-7721)和人慢性髓原白血病细胞(K562)购自中国科学院细胞库，在含有10%小牛血清的RPMI1640培养基中，于5%CO2、湿度90%以上、37℃温箱中培养，贴壁细胞用0.25%胰酶消化。

1.2仪器和试剂北京泰克X-5型显微熔点仪(温度未校正)；APIQSTARPulsar质谱仪；BruckerAV-400型超导核磁仪(TMS为内标)；BruckerAV-500型超导核磁仪(TMS为内标)；CO2培养箱(SheldonManufacturingInc.)；超净工作台(上海博讯实业有限公司医疗设备厂)；MK3酶标仪(上海雷勃分析有限公司)。柱层析硅胶(200~300目)和薄层层析硅胶(青岛海洋化工厂)，SephadexLH-20(Merck公司)。四甲基偶氮唑盐(MTT)、RPMI1640培养基和平衡盐溶液PBS(北京欣经科公司)；丝裂霉素C(KyowaHakkoKogyoCo.Ltd.)，DMSO为分析纯，提取和分离所用试剂均为重蒸工业试剂。

1.3提取和分离酒饼簕根晒干后加工成粗粉(8.4kg)，用体积分数为95%的乙醇热回流提取3次，每次10L；减压浓缩至无乙醇味后得粗浸膏，粗浸膏分散于水中成为悬浊液，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，得到石油醚部分(127.5g)、乙酸乙酯部分(183.0g)和正丁醇部分(293.0g)。乙酸乙酯部分(183.0g)采用常压干柱柱层析，以石油醚-丙酮(1∶1)洗脱，分段收集，薄层检查，合并相同部分，回收溶剂，浓缩收集得到7个组分(Fr.1~7)。Fr.1(28.2g)经硅胶柱层析,以石油醚-乙酸乙酯(6∶1~0∶1)梯度洗脱，得到15个亚组分(Fr.1.1~Fr.1.15)。Fr.1.5(1.8g)依次经SephadexLH-20(三氯甲烷-甲醇1∶1)和反复硅胶柱层析(石油醚-乙酸乙酯14∶1)洗脱得到化合物1(140.1mg)；Fr.1.4(1.6g)经反复硅胶柱层析，以石油醚-乙酸乙酯(16∶1)洗脱得到化合物2(12.7mg)和化合物8(120.6mg)；Fr.1.7(1.5g)经硅胶柱层析，以石油醚-丙酮(12∶1)洗脱得到7个组分(Fr.1.7.1~Fr.1.7.7)；Fr.1.7.4(770.0mg)经反复硅胶柱层析，以石油醚-丙酮(16∶1)洗脱得到化合物3(9.4mg)；Fr.1.7.6(231.1mg)经反复硅胶柱层析，以石油醚-丙酮(10∶1)洗脱得到化合物4(16.2mg)；Fr.1.7.5(152.9mg)依次经SephadexLH-20(三氯甲烷-甲醇1∶1)和硅胶柱层析(石油醚-丙酮12∶1)洗脱得到化合物5(20.1mg)；Fr.1.9(1.0g)经反复硅胶柱层析，以石油醚-丙酮(6∶1)洗脱得到化合物6(30.7mg)；Fr.1.10(2.2g)经反复硅胶柱层析，以石油醚-丙酮(9∶1)洗脱得到化合物7(4.7mg)。Fr.6(49.4g)经硅胶柱层析,以三氯甲烷-甲醇(1∶0~0∶1)梯度洗脱，得到13个亚组分(Fr.6.1~6.13)。Fr.6.4(7.2g)依次经SephadexLH-20(三氯甲烷-甲醇1∶1)和反复硅胶柱层析(石油醚-乙酸乙酯11∶2)洗脱得到化合物9(2.0mg)。

1.4细胞毒活性筛选方法采用MTT法[15]。实验设阴性对照组(DMSO溶剂)、阳性对照组(丝裂霉素C)和6个不同浓度(0.2，0.6，1.8，5.4，16.2和48.6μgmL-1)的待测样品，每个浓度设3个平行。选取对数生长期细胞，用RPMI1640完全培养基制成单细胞悬浮液，血球计数板计数，按50000个mL-1接种90μL于96孔平底细胞培养板，置于5%CO2、湿度90%以上、37℃温箱中培养。在K562细胞中直接加入待测样品10μL，而SMMC-7721和SGC-7901培养24h后加入待测样品10μL，继续培养72h后取出，置于显微镜下观察每孔细胞形态。然后每孔加入5mgmL-1的MTT溶液(溶于平衡盐溶液PBS)15μL，37℃反应4h后，吸弃上清液，再向各孔加入100μLDMSO，充分溶解，将细胞培养板置于酶标仪上，用490nm波长测量各孔的吸光度(A)，计算生长抑制率(%)＝(1–用药组平均A值/阴性对照组平均A值)×100%。以样品浓度为横坐标，以抑制率为纵坐标，根据浓度梯度利用origin软件拟合出抑制率的曲线图，求出抑制率为50%时样品的浓度(IC50)，样品活性结果即以IC50表示。

1.5结构鉴定BuxifoliadineA(1)　　黄色针晶(丙酮),见表1。上述波谱数据与文献[8]报道基本一致，故鉴定为BuxifoliadineA。

1.6细胞毒活性以上化合物经MTT法进行细胞毒活性筛选，结果表明化合物1对人肝癌细胞(SMMC-7721)有弱活性，其IC50为62.5μgmL-1；化合物3对人慢性髓原白血病细胞(K562)有明显的抑制作用，其IC50为0.20μgmL-1；化合物8对人肝癌细胞(SMMC-7721)有明显的抑制作用，其IC50为2.0μgmL-1；其余化合物对这两株肿瘤细胞未显示生长抑制活性。阳性对照丝裂霉素C对SMMC-7721和K562的IC50分别为2.20μgmL-1和7.10μgmL-1。

2结果和讨论

本研究对酒饼簕根的化学成分及其细胞毒活性进行研究，从中分离鉴定出9个化合物，分别为buxifoliadineA(1)、1,3-dihydroxy-2,4-diprenylacridone(2)、5-hydroxy-N-methylsever-ifoline(3)、buxifoliadineB(4)、N-methylatalaphylline(5)、atalaphylline(6)、东风桔碱(7)、葡萄内酯(8)和松柏醛(9)。化合物9为首次从酒饼簕中分离得到。体外细胞毒活性筛选结果表明，化合物1和8对人肝癌细胞(SMMC-7721)具有细胞毒活性，化合物3对慢性髓原白血病细胞(K562)的增殖显示了较强的生长抑制活性。本研究首次对化合物1和8对人肝癌细胞(SMMC-7721)的细胞毒活性和化合物3对慢性髓原白血病细胞(K562)的细胞毒活性进行了报道。

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