黄额闭壳龟( Cuora galbinifrons) 又叫 “黄额盒龟”，隶属于龟科( Emydidae) 闭壳属( Cuora) ，国内主要分布于广东、广西以及海南，国外分布在越南、老挝等地［1 －2］。中国是黄额闭壳龟主要的消费国，大量黄额闭壳龟被食用或药用。黄额闭壳龟的人工饲养十分困难，主要是因为该龟种适应环境能力欠佳，在养殖过程中容易患病死亡。目前，关于黄额闭壳龟的研究主要集中在形态分类、地理分布、人工饲养及贸易等方面［3 －4］，有关黄额闭壳龟的病害防治技术研究鲜有报道。2012 年，武汉某养殖户处于冬眠状态的黄额闭壳龟发病，患病龟从冬眠状态苏醒，体质消瘦，舌部发白，加温饲养发现病龟拒食、活动少、精神不振，几天后死亡。解剖后发现体腔及肠道内大量胀气、少量腹水、消化道粘膜充血，其他器官未发现明显的病变。于无菌条件下从病龟肝脏组织中分离培养出细菌一株，对健康巴西龟进行人工感染试验可复制与自然发病黄额闭壳龟相同的症状，确定其致病性。经 Biolog 微生物自动鉴定系统的鉴定和分子生物学检测确定，该致病菌为产酸克雷伯菌( Klebsiella oxytoca) 。药物敏感性试验显示，该菌对头孢类抗生素高度敏感。本项研究为龟类细菌性疾病的防控技术研究奠定了一定的基础。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

1. 1. 1 试验动物

患病黄额闭壳龟采集于武汉某养殖户，腹甲长10 cm。用于感染试验的健康巴西龟购于武汉堤角花鸟大世界，平均体重为( 20 ± 1. 0) g，暂养在60 cm × 40 cm × 20 cm 塑料箱内，养殖用水为充分曝气的自来水，一周后用于感染试验，试验控制水温( 25 ±1) ℃。

1. 1. 2 主要试剂和仪器

BHI( BD，BectoTMBrain Heart Infusion) ，PCR产物纯化试剂盒( Promega，Wizard Sv Gel and PCRClean up System) ，药敏试剂盒( 杭州天和微生物试剂有限公司) ，全自动微生物鉴定仪( Biolog，Bi-olog GEN Ⅲ，USA) ，生物安全柜( ESCO，Class ⅡBSC，Singapore) ，离心机( SiGMA，3K15，Germa-ny) ， 化 学 发 光 成 像 与 分 析 系 统 ( BiO － RAD，ChemiDocTMXRS + ， USA ) ， PCR 仪 ( Biometra， T－ professional，Germany) ，生化培养箱 ( 上海新苗医疗器械制造有限公司，Spx － 250BS － Ⅱ) ，透射电子显微镜( Hitachi，H －7650，Japan) 。

1. 2 致病菌分离与培养

取濒死黄额闭壳龟，用 70% 酒精消毒体表，在生物安全柜中无菌操作取肝脏于 BHI 琼脂平板上划线接种，置 30 ℃培养，24 h 后挑取形态特征一致的优势菌落在相同的条件下作纯培养，并挑取菌株通过负染法于电镜下观察其形态［5］。纯培养物接种 BHI 液体培养基扩大培养，培养菌液分装到冻存管中加甘油( 终浓度 25%) 于 － 80 ℃ 保存备用。菌株编号为 HE01。

1. 3 人工感染试验

取保存的菌种接种于 BHI 培养液中，培养24 h后 4 000 g 离心集菌，所得菌体用无菌 PBS 离心洗涤 3 次，McFarland 比浊法结合平板菌落计数法测定细菌浓度，并调整细菌浓度为 1 × 109CFU / mL，10 倍梯度稀释得到 1 × 108CFU / mL、1 × 107CFU /mL 和 1 × 106CFU / mL，共 4 个浓度梯度用于健康龟的注射感染试验。巴西龟的注射感染试验: 取暂养 1 周后的健康巴西龟随机分成 5 组，每组 30 只，4 个试验组以 0. 2 mL / 只的剂量分别腹腔注射 4 种浓度的菌悬液，对照组以 0. 2 mL/只的剂量腹腔注射 PBS。每天观察记录死亡情况。取人工感染死亡的巴西龟进行细菌的分离和鉴定，以确定所分离的病菌的致病性。

1. 4 微生物鉴定

取经过纯培养 BHI 固体培养基纯培养的 HE01菌株采用单菌落划线接种于 BUG 鉴定平板上，30 ℃ 培养 16 ～ 24 h，待菌落大小适宜时，取 Biolog细菌鉴定试剂盒 IF － A 接种液，将管外壁擦拭干净，置于 Biolog 浊度仪中，调整其读数为 100% T;用无菌棉签蘸取适量的单菌落至接种液中，使浊度仪读数在 92% ～98%T 之间，用8 孔排枪将混合液转移至 GENⅢ鉴定板中，每孔 100 μL，将鉴定板装载于 Biolog 系统中培养，系统自动读数并输出鉴定结果。

1. 5 16 S rDNA 序列的扩增和测定

取保存的菌种接种 BHI 液体培养基，30 ℃ 培养 24 h 离心集菌。参照 GenElute Bacterial GenomicDNA Kit 使用说明书提取细菌总 DNA。用于 16 SrDNA 序列扩增的引物为细菌的通用引物，上游引物为: CACGGA TCC AGA GTT TGA T( C/T) ( A/C)TGG CTC AG，下游引物为: GTG AAG CTT AGG G( C/T) T ACC TTG TTA CGA CTT。采用50 μL 反应体系进行 PCR 扩增: 10 × PCR Buffer 5 μL，dNTP( 10 mmol/L) 1 μL，Primers( F/R，10 μmol/L) 各1 μL，rTaq DNA 聚合酶( 5 U / μL) 0. 5 μL，DNA 模板为 1 μL，ddH2O 补足至 50 μL。PCR 扩增程序为: 95 ℃预变性 5 min; 95 ℃变性1 min，55 ℃退火 1 min，72 ℃延伸2 min，30 个循环; 72 ℃延伸10 min。PCR 产物经 0. 8% 琼脂糖凝胶电泳检测，胶回收试剂盒回收，送上海生工生物工程有限公司测序。

1. 6 序列同源性分析及系统发育树的构建

将测得菌株的 16 S r DNA 序列通过 NCBI 的Blast 检索系统进行序列同源性分析。检索出相似较高的序列采用 Clustal X( 1. 83) 进行多序列匹配排列 ( Multiple Alignments) 。参 照 文 献［6］使 用MEGA 4. 0 软件， 采用邻接法 ( Neighbor － joiningmethod) 构建系统发育树，并通过 1 000 次的自举分析( boos trap) 进行置信度检测。

1. 7 药敏试验

采用纸片扩散法( K － B 法) 进行药敏性试验。取 100 μL 新鲜菌悬液( 浓度约 1 ×107CFU / mL) 均匀涂布于 BHI 固体培养基上，用无菌镊子将 35 种药敏纸片均匀贴在平板上，30 ℃培养 24 h 后测量抑菌圈直径。

2 结果

2. 1 致病菌分离镜检结果

从患病黄额闭壳龟的肝脏中分离到一株优势菌。该菌株在 BHI 培养基上 30 ℃培养24 h 后出现菌落大小为 1 ～ 2 mm，圆形，边缘整齐，半透明，乳白色或淡黄色，有光泽菌落。负染染后电镜观察，该菌株呈杆状，周身鞭毛( 图 1) 。

2. 2 人工感染试验结果

人工感染试验结果见表 1。由表可知，菌液浓度为 1 ×106CFU / mL 和 1 × 107CFU / mL 组注射巴西龟，在染毒后 7 d 内没有出现死亡; 1 × 108CFU / mL 组巴西龟在 8 d 内累积死亡率达到 15% ;1 × 109CFU / mL 组巴西龟在 8 d 累积死亡率达到55% ，说明该菌株对巴西龟具有一定的致病性。人工感染死亡的巴西龟解剖后，腹腔有少量腹水，体腔及肠道内有胀气，消化道粘膜有轻微充血。

2. 3 Biolog 全自动微生物鉴定仪的鉴定结果

从患病黄额闭壳龟、人工感染死亡的巴西龟中分离的细菌经 Biolog 全自动微生物鉴定系统鉴定为同一种细菌。菌株 HE01 的鉴定结果表明，该菌株为产酸克雷伯菌的可能性达 85%。各项参数为:PROB = 0. 85; SIM = 0. 525; DIST = 4. 807。具体的反应项目及结果见表 2。

2. 4 16 S rDNA 序列分析及系统发育树的构建

用细菌 16 S rDNA 通用引物 PCR 扩增获得该菌株的 16 S rDNA 基因片段( 图 2) ，对此片段进行回收、测序，得到 1449 bp 的序列。将测序所得序列输入到 NCBI 进行 Blast 检索，发现 HE01 菌株与克雷伯菌属( Klebsiella) 细菌的 16 S rDNA 序列自然聚类。在最相近的 100 个序列中，克雷伯菌属细菌占 60%，肠杆菌属细菌占 40%，HE01 与它们的同源性为 99% ～100%，从中选择同源性较高的克雷伯菌属以及其他属细菌的 16 S rDNA 基因序列，并以假单胞菌属细菌( Pseudomonas sp) 为外群，进行分子系统发育分析。结果如图 3 所示，菌株 HE01与 Klebsiella oxytoca( HE650838. 1) 和 Klebsiella pneu-moniae( AB 680619. 1) 聚合，且置信度高达 100%。

2. 5 药敏试验结果

药敏试验结果见表 3。药物敏感试验表明，该菌株对头孢噻肟、头孢曲松、头孢哌酮等 10 种药物敏感; 对头孢呋肟、哌拉西林、阿米卡星、氯霉素等 8 种药物中度敏感; 对四环素、克林霉素、红霉素、克拉霉素等 17 种药物不敏感。与已报道的其它动物分离出的产酸克雷伯菌的药敏试验进行了对比，发现虽然同为产酸克雷伯菌，但不同生物来源的菌株对药物的敏感性不尽相同，但是不同来源的菌株均对庆大霉素敏感( 表 4) 。

3 讨论

产酸克雷伯菌是革兰氏阴性短杆菌，需氧或兼性厌氧，属于肠杆菌科，电镜下观察两端钝圆、无芽孢、外有荚膜包围。克雷伯菌属包括 5 个种，即肺炎克雷伯菌( 含 3 个亚种: 肺炎亚种、鼻臭亚种、鼻硬结亚种) 、产酸克雷伯菌、土生克雷伯菌、植生克雷伯菌及变形克雷伯菌。后 3 个种是新近发现的，致病力低［10］。据报道，在多种动物体内分离到该菌属的细菌，如肺炎克雷伯菌引起鸭［11］、仔猪［12］、竹鼠［13］、鸡［14］以及大熊猫［15］等发病，产酸克雷伯菌可引起抗生素相关性出血性结肠 炎 ( antibiotics － associated hemorrhagic colitis，AHC)［16］，引发乌骨鸡和孔雀患病，但该菌引发龟发病还属首例报道。本次试验中分离到产酸克雷伯菌可导致腹腔有少量腹水，体腔及肠道内有胀气，消化道粘膜有轻微充血等症状，人工感染试验证明其对巴西龟有一定的致病性。借助 Biolog 全自动微生物鉴定系统进行生化检测，进一步确定分离得到的菌株就是产酸克雷伯菌。Biolog 全自动微生物鉴定系统( Omilog GENⅢ) 鉴定结果具有准确、迅速、不依赖手工操作等特点，显著优于常规的生理生化鉴定方法［17］。在Biolog 鉴定结果中，DIST 和 SIM 是最重要的两个值。DIST 值表示鉴定结果与数据库相应的数据条的匹配程度，DIST≤5. 0 时匹配良好。在获得良好鉴定结果时，SIM 值在培养 4 － 6 h 时应≥0. 75，培养 16 －24 h 时 SIM 值应≥0. 50。在本项研究的细菌鉴定中，DIST 值为 4. 807，SIM 值为 0. 525，表明鉴定结果准确。而与产酸克雷伯菌同属的肺炎克雷伯菌在鉴定结果中的数值分别是，DIST 值为8. 830，SIM 值为 0. 017。系统计算出该菌为产酸克雷伯菌的可能性是 85%，而肺炎克雷伯菌的可能性为 3. 7%。结合 16 S rDNA 基因序列比对结果和Biolog 全自动微生物鉴定系统结果确定该菌为产酸克雷伯菌。药物敏感性试验结果对黄额闭壳龟的产酸克雷伯菌感染症的防治提供了一些科学依据。而黄额闭壳龟产酸克雷伯菌与其它水产生物来源的产酸克雷伯菌的药敏结果不尽相同，在本实验中我们还发现，所选 35 种药物中有 17 种对该菌株不敏感，这可能与生物体不同有关系，也可能与滥用药物导致菌株抗药性改变有关，这无疑给该菌的药物防治带来了困难。针对不同生物来源的菌株进行针对性的药物筛选试验，选择最有效的药物进行治疗或预防，可防止细菌抗药性的产生。黄额闭壳龟养殖业的规模在不断地发展，然而对其病害的研究很少，而采用先进仪器设备以及分子鉴定的方法对黄额闭壳龟细菌性病原进行系统研究的结果更是缺乏。本试验首次从黄额闭壳龟中分离到了产酸克雷伯菌，并确定了其致病性，为黄额闭壳龟病害防治提供了科学依据。

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