本文作者：林世锋 王仁刚 王 轶 张吉顺 任学良 单位：贵州省烟草科学研究所

烟草是世界上广泛种植的叶用经济作物，烟叶的香气是衡量其品质和可用性的核心内容和重要指标之一，烟草品质的优劣很大程度上取决于烟叶的香味品质［1-2］。类胡萝卜素是影响烟叶香味品质的主要成分之一，它不仅决定了调制后烟叶的颜色，其相关降解产物与烟叶的香气质和香气量也有密切关系［3-4］。因此，对烟叶类胡萝卜素及相关影响因素的研究一直是国内外烟草业的热点之一［5-7］。β-胡萝卜素羟化酶（BCH）是植物类胡萝卜素合成代谢途径中的关键酶，它在植物叶黄素的生物合成中催化了β-胡萝卜素经中间产物β-隐黄素合成玉米黄素的过程［8］。许多植物如拟南芥［9］、辣椒［10］中已成功地分离出该基因，但在烟草中尚未见分离该基因的相关报道。烟草与辣椒同属茄科植物，物种间同源基因序列相对保守，以此为切入点，以辣椒BCH基因cDNA序列为探针，通过电子克隆方法获得1个烟草BCH基因并进行RT-PCR验证和生物信息学分析，旨在为烟草类胡萝卜素合成的调控和烟草BCH基因功能的研究提供依据。

1材料与方法

1.1烟草β-胡萝卜素羟化酶基因的电子克隆以辣椒β-胡萝卜素羟化酶基因的全长cDNA序列（GenBank登录号：Y09225）［10］为信息探针，对GenBank中EST_others数据库指定物种烟草（Nicotianatabacum）进行BLAST检索，将检索到的来自于烟草栽培品种K326的全部EST序列利用DNAMAN6.0软件进行拼接，形成重叠群（contig）。然后以此重叠群再次进行同源检索、拼接，重复以上过程直至没有更多烟草栽培品种K326的重叠EST检出，最终获得烟草栽培品种K326的β-胡萝卜素羟化酶cDNA序列片段。再以此片段在GenBank中进行BlastX同源搜索，与其他物种的β-胡萝卜素羟化酶同源蛋白进行序列比对，进而判断拼接得到的烟草β-胡萝卜素羟化酶基因cDNA的正确性以及其ORF序列的完整性。

1.2烟草β-胡萝卜素羟化酶基因的克隆

1.2.1供试材料烟草栽培品种K326在光照培养室中培养，取培养30d的烟苗叶片为试验材料；宿主菌E.coliDH5α由本实验室培养；质粒pMD18-TVector为TaKaRa公司产品。总RNA抽提所用的试剂盒RNeasyPlantMiniKit购自Qiagen公司；TaqDNA聚合酶、DNA分子质量标准DL2000和DNA凝胶回收试剂盒为TaKaRa公司产品；反转录试剂盒为Invitrogen公司产品。

1.2.2烟草叶片RNA的提取及cDNA第一条链的合成烟草叶片总RNA的提取按照RNeasyPlantMiniKit（Qiagen，German）说明书操作。cDNA的合成按照反转录试剂盒说明书步骤进行。

1.2.3引物设计与合成以电子克隆所得到的完整cDNAORF（编码309个氨基酸残基）序列为依据，设计合成特异引物，P1：5′-CTCTCTATCTCTCTCTCTCTCTCAACGC-3′；P2：5′-AGAGAGCCAGAGGACATTCAATTATTAGC-3′。特异引物由上海生工生物公司合成。

1.2.4PCR扩增烟草BCH基因片段用所设计的特异引物，以供试烟草cDNA为模板扩增特异片段。PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性0.5min，53℃复性0.5min，72℃延伸1.5min，共30个循环；72℃延伸10min。反应完毕后取5μL的PCR产物进行1%的琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.5重组测序质粒的构建、克隆和DNA序列测定PCR产物经割胶回收后与载体pMD18-TVector（摩尔比3∶1）连接，4℃过夜。连接产物转化到大肠杆菌中，在X-gal/IPTGAmp平板上挑选白色克隆，由上海英骏生物技术有限公司完成DNA序列测定。1.3烟草β-胡萝卜素羟化酶基因的生物信息学分析利用NCBI网站（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）提供的ORFfinder软件对开放阅读框进行分析并翻译成蛋白质，通过BlastP程序进行序列相似性分析和氨基酸保守性预测；运用DNAMAN6.0软件进行氨基酸序列的多重比对；利用瑞士生物信息研究所网站（http://www.expasy.org/tools/）提供的ProtParam，NetPhos，TMHMM和SOPMA软件进行蛋白的基本特性、磷酸化位点、跨膜性和二级结构进行分析和预测；运用DNAMAN6.0，ClustalX2.0和MEGA3.1软件进行蛋白质的氨基酸序列比对和进化树分析。

2结果与分析

2.1烟草β-胡萝卜素羟化酶基因的电子克隆利用已知的辣椒β-胡萝卜素羟化酶基因的核苷酸序列对GenBank中烟草EST数据库进行BLAST检索分析，发现7条相似性高的EST序列来自烟草品种K326，通过DNAMAN6.0软件将它们进行重叠群的装配后，获得contig成分及各个序列的拼接位置，如图1所示。在组成的contig中，各条EST序列的拼接顺序为：EB450833，EB440086，EB449504，EB439198，FG643733，DW001435，EB682815。通过拼接获得一条长度为1215bp的一致性序列，见图1。

2.2烟草β-胡萝卜素羟化酶基因的RT-PCR验证通过对烟草EST数据库的BLAST检索及反复拼接，最终获得长度为1215bp的烟草BCH基因的cDNA序列，经NCBIORFfinder分析，该基因包括一个长度930bp的开放阅读框，编码309个氨基酸残基，所编码的蛋白质在150~269氨基酸处存在1个典型的FA_hydroxylasesuperfamily（脂肪酸羟化酶超家族）保守结构域。将该基因命名为NtBCH1。采用RT-PCR的方法对上述结果进行了验证，经1%琼脂糖凝胶电泳分析，结果出现单一条带，约1.2kb，与预计大小相符，见图2。用pMD18-TVector克隆后测序，结果与电子克隆序列一致，见图3。该基因的序列已在GenBank注册，登录号为JQ410446。

2.3NtBCH1蛋白质的理化性质利用ProtParam软件对NtBCH1的氨基酸序列进行基本特性分析，结果显示，NtBCH1蛋白的分子式为C1586H2431N423O428S14，分子量为34721.1Da，理论等电点pI8.68。该蛋白含Leu（L）最多，占9.4%；其次为Ala（A），占8.4%；Glu（E）与Gly（G）数量相同，均占8.1%。总的带正电残基（Arg+Lys）为33，负电残基（Asp+Glu）为30。总的亲水性平均系数为0.003，预测该蛋白属于疏水性蛋白。该蛋白预测不稳定指数为50.87，属于不稳定蛋白。

2.4烟草BCH1蛋白质的磷酸化位点通过对NtBCH1中丝氨酸激酶、苏氨酸激酶和酪氨酸激酶的磷酸化位点进行在线分析（图4），发现NtBCH1含有10个丝氨酸激酶磷酸化位点（第7，10，44，49，88，101，150，269，306和309位氨基酸）和1个苏氨酸激酶磷酸化位点（第16位氨基酸），不含有酪氨酸激酶磷酸化位点。说明磷酸化位点修饰对BCH蛋白的功能可能非常重要，也可能是这些磷酸化作用参与BCH蛋白活性的调控。

2.5烟草BCH1蛋白质的跨膜性采用TMHMM对烟草β-胡萝卜素羟化酶蛋白的跨膜性区域（transmembranehelices，TMhelices）进行预测，结果如图5所示。TMHMM预测出NtBCH1存在4个跨膜区域，分别是：104aa-126aa，141aa-163aa，194aa-211aa，215aa-237aa。膜内区域有3个，分别是：laa-103aa，164aa-193aa，238aa-309aa。膜外区域有2个，分别是：127aa-140aa，212aa-214aa。

2.6NtBCH1蛋白质的高级结构预测运用SOPMA软件分析NtBCH1蛋白的二级结构，如图6所示，α-螺旋约占46.28%，延伸直链约占14.89%，β-转角约占6.80%，无规则卷曲约占32.04%，其中α-螺旋为主要结构。

2.7不同物种间β-胡萝卜素羟化酶蛋白同源性比较通过NCBI网站的BLAST比对结果发现，该基因的氨基酸序列与β-胡萝卜素羟化酶蛋白有非常高的相似度。其中与番茄BCH蛋白（Solanumlycopersicum，NP_001234348）一致性最高，达84%；其次与辣椒BCH蛋白（Capsicumannuum，BCH2_CAPAN）的一致性为83%（图7）。用Mega3.1软件将推导的氨基酸序列与GenBank中的其他植物的16个β-胡萝卜素羟化酶基因的氨基酸序氨基酸列进行聚类分析，结果表明，在同科植物番茄、辣椒中均存在多种BCH基因（图8），因此烟草中也可能存在不同编码基因。本试验只得到其中的1个基因，其他的基因还有待进一步研究。

3结论与讨论

电子克隆（Insilicocloning）是近年来伴随着基因组计划和EST计划而发展起来的基因克隆新方法［11］，依赖于各种生物信息数据库，利用生物软件拼接延伸EST序列，获得目的基因的部分乃至全长的cDNA序列。本研究以辣椒BCH基因cDNA序列作为探针，对烟草EST数据库进行检索拼接，成功克隆到1个烟草BCH基因。在电子克隆检索过程中，目标物种锁定烟草（Nicotianatabacum），全部EST序列来源于同一品种K326，避免了品种间基因多态性造成序列拼接工作的复杂性，进而提高了电子克隆的准确性。到目前为止，BCH基因已从拟南芥、玉米、龙胆、福寿草和水仙花等植物中分离出来，其cDNA长1.1~1.5kb，编码308~320个氨基酸，分子量为34.36~35.55kD，理论等电点为8.81~9.81，含有最丰富的氨基酸包括Ala，Leu和Gly。BCH编码的氨基酸序列中都含有3~4个跨膜结构域，1个功能结构域，二级结构均以α-螺旋和无规则卷曲为主要构件［12］。对烟草栽培品种K326BCH基因编码的309个氨基酸序列分析中也发现了这些序列特征。此外，已有文献报道β-胡萝卜素羟化酶含10个保守组氨酸,它们形成两组“HXXXXH”+“HXXHH”模体，在催化过程中起着十分重要的电子传递作用。缺少或改变其中1个保守组氨酸,也会大大降低酶的活性［10,13］。本试验结果烟草β-胡萝卜素羟化酶中同样含有这样两组组氨酸模体，这充分说明了所得序列确实为β-胡萝卜素羟化酶基因。总之，从烟草栽培品种K326中克隆到了1个β-胡萝卜素羟化酶基因，通过生物信息学技术对其编码蛋白的理化性质、磷酸化位点、跨膜结构域、功能结构域及二级结构等重要参数进行了预测与分析，并推测了与其他物种的生物进化关系。但对该基因的功能分析以及在烟草类胡萝卜素合成调控中的具体作用尚有待进一步研究。

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