玉米矮花叶病毒是一种全球性的玉米病毒,发病面积广泛,损失巨大[1]。对玉米矮花叶病的抗病育种工作十分紧迫和重要。研究人员采用花粉介导的方法[2],将水稻粗缩病毒运动蛋白缺陷型基因(RDVMP)导入玉米自交系“478”中,获得了具有抗矮花叶病毒的玉米,因而提高了玉米的抗病性。到目前为止,在转基因操作中对外源基因的插入位点尚无法准确控制,插入外源基因可能带来一些意想不到的效应,由于无意识的基因变化可能改变新陈代谢及酶活性和功能的变化,从而引起转基因植物生理生化的变化问题[3],包括酶活性、同工酶及营养成分的变化[4]。杜建中等[5]对转RDVMP基因玉米的抗病性进行了研究,发现转基因玉米抗矮花叶病强于受体玉米。但现少见关于转RDVMP基因玉米生长过程生理特性的研究报道。本文以转RDVMP基因玉米(转基因抗矮花叶病玉米)及其亲本(非转基因玉米)为研究对象,在实验室条件下,对其发育过程中淀粉酶、蛋白酶、POD、CAT、SOD酶活性、同工酶酶谱分析以及蛋白质含量、叶绿素含量和可溶性糖含量等进行研究,旨在探讨转入的RDVMP基因是否会对这些酶产生影响,为转基因玉米的推广及规范化栽培技术的制定提供理论基础。

1试验材料与方法

1.1供试材料

供试的转基因玉米和亲本玉米材料由山西农业科学院生物技术研究中心提供。亲本玉米编号为“478”;转基因玉米为将水稻粗缩病毒运动蛋白缺陷型基因(RDVMP)通过花粉介导的方法转入受体玉米“478”中获得抗矮花叶病毒的转基因玉米。

1.2种子萌发及取样

将转RDVMP基因玉米种子和非转基因玉米种子于25℃黑暗中经蒸馏水浸泡24h后,用蒸馏水冲洗数次。分别选取200粒饱满健壮的种子,置于铺垫1层滤纸、2层纱布的培养皿中,置于25~30℃人工气候培养箱中萌发培养,设3次重复,逐日记录发芽数。第3d计算发芽势,第7d计算发芽率[6]。另取适量玉米种子进行上述萌发培养,分别于第3d、5d、7d测定其蛋白酶、淀粉酶活性及可溶性总蛋白、可溶性总糖含量(取萌发的去根种子)。第8d于25℃无光照恒温箱中进行水培,每24h浇1/2Hoogland培养液350L,待玉米长出真叶后,测定其叶绿素a、b含量及CAT、POD、SOD活性,进行CAT、POD、SOD同工酶电泳分析。

1.3生理生化指标测定方法

淀粉酶活性采用比色法测定,以25℃时3min内每1g种子(鲜重)水解淀粉释放1mg麦芽糖所需的酶量为1个酶活性单位(U•g1)[7]。蛋白酶活性采用甲醛滴定法测定,以氨态氮的量来衡量蛋白酶的活性(U•g1)[7]。可溶性总糖含量采用蒽酮比色法测定,从标准曲线上得到提取液中糖的含量,进而求出可溶性总糖含量(g•g1)[7]。可溶性总蛋白含量采用考马斯亮蓝法G-250比色法测定,通过标准曲线可以求得样品蛋白的浓度,求出蛋白质的含量(g•g1)[7]。叶绿素含量采用丙酮提取法测定,以每克鲜重叶片中叶绿素的毫克数(mg•g1)表示[8]。SOD活性采用NBT光还原法[9],POD活性采用愈创木酚法测定[8],CAT活性采用紫外吸收法测定[8]。

1.4同工酶分析方法

SDS-聚丙烯凝胶电泳条件为分离胶浓度12.5%,浓缩胶浓度4.5%,胶联度3.6%,进行垂直电泳,单板恒流10mA,样品溶液先与等体积上样缓冲液混合,沸水浴加热5min后,蛋白提取液20μL上样,电泳后的分离胶染色显现蛋白带。POD染色用醋酸联苯胺法[10],CAT染色参考杨小艳等[11]的方法,SOD染色参考李学强等[12]的方法。

1.5数据分析

用Excel软件和SPSS软件进行数据分析。

2结果与分析

2.1玉米萌发过程中生理指标的对比

2.1.1发芽指标的对比

萌发期转基因抗矮花叶病玉米和非转基因玉米发芽指标的变化如表1所示。从表中可看出,转基因玉米的发芽率、发芽势和发芽指数与非转基因亲本之间存在一定差异,但均未达到显著水平(P>0.05)。

2.1.2发芽种子淀粉酶和蛋白酶活性的对比

转基因抗矮花叶病玉米和非转基因玉米在萌发期淀粉酶活性的变化如图1A所示。通过3个时间的测定发现,在正常萌发条件下,转基因玉米与非转基因玉米的淀粉酶活性随着萌发天数的增加逐渐降低,且萌发过程中转基因玉米淀粉酶活性始终比非转基因玉米高。在萌发的第3d,转基因玉米的淀粉酶活性比非转基因玉米增加86.71%,二者差异达极显著水平(P<0.01)。在萌发的第5d和第7d,与非转基因玉米相比,转基因玉米的淀粉酶活性分别高34.51%和17.33%,差异显著(P<0.05)。萌发期转基因抗矮花叶病玉米和非转基因玉米蛋白酶活性的变化如图1B所示。通过3个时间的测定发现,在正常萌发条件下,萌发期转基因玉米的蛋白酶活性比非转基因玉米高。在萌发第3d,转基因玉米的蛋白酶活性比非转基因玉米高66.66%,二者差异显著(P<0.05)。随着萌发天数的增加,二者均呈下降趋势,到萌发第5d和第7d,二者酶活性趋向一致,差异不显著(P>0.05)。

2.1.3可溶性总糖含量和可溶性总蛋白含量的对比

萌发期转基因抗矮花叶病玉米和非转基因玉米可溶性总糖含量的变化如图2A所示。通过3个时间的测定发现,转基因玉米与非转基因玉米的可溶性总糖含量差异始终表现为极显著(P<0.01)。转基因抗矮花叶病玉米和非转基因玉米可溶性总蛋白含量在萌发期的变化如图2B所示。通过3个时间的测定发现,在正常萌发条件下,随着萌发天数的增加,转基因玉米与非转基因玉米可溶性总蛋白含量的变化趋势相似,均在萌发的第5d有所上升,第7d又转为下降。在萌发的第3d和第7d,转基因玉米可溶性总蛋白含量与非转基因玉米的差异不显著(P>0.05);萌发第5d,差异显著(P<0.05)。

2.1.4叶绿素含量的对比

转基因抗矮花叶病玉米和非转基因玉米叶片叶绿素含量的变化如表2所示。转基因玉米叶片叶绿素a、叶绿素a＋b的含量与非转基因玉米的差异均显著(P<0.05);叶绿素b的含量、叶绿素a/b与非转基因玉米的差异不显著(P>0.05)。

2.2玉米萌发过程中不同组织保护酶活性(CAT、POD和SOD)的变化

转基因抗矮花叶病玉米与非转基因玉米胚芽和第1真叶CAT活性的变化见图3A。转基因玉米与非转基因玉米胚芽中CAT活性之间没有显著差异,第1真叶中CAT活性差异显著(P<0.05)。两种玉米第1真叶与胚芽中CAT活性差异极显著(P<0.01),转基因玉米第1真叶较胚芽中CAT活性增加187.15%,而非转基因玉米的增加170.12%。转基因抗矮花叶病玉米与非转基因玉米胚芽、第1真叶POD活性的变化见图3B。转基因玉米与非转基因玉米胚芽组织中POD活性之间没有显著差异,第1真叶中POD活性差异显著(P<0.05)。两种玉米第1真叶与胚芽中POD活性差异极显著(P<0.01),转基因玉米第1真叶较胚芽中POD活性增加157.54%,而非转基因玉米增加109.57%。转基因玉米与非转基因玉米胚芽、第1真叶SOD活性的变化见图3C,转基因玉米与非转基因玉米胚芽组织中SOD活性之间没有显著差异;第1真叶中SOD活性差异显著(P<0.05)。两种玉米第1真叶与胚芽中SOD活性差异极显著(P<0.01),转基因玉米第1真叶较胚芽中SOD活性增加了62.53%,而非转基因玉米的增加了48.80%。

2.3玉米胚芽、第1真叶中POD、CAT、SOD同工酶的谱带分析

由表3可以看出,转基因抗矮花叶病玉米和非转基因玉米胚芽中的POD都有3条同工酶谱带,分别为POD-1、POD-3和POD-4。转基因玉米和非转基因玉米第1真叶中都有POD-1、POD-2、POD-3和POD-4,转基因玉米第1真叶含有POD-5,而在胚芽中未检测到此条泳带。转基因玉米胚芽中泳带较非转基因玉米亮度强,说明转基因玉米胚芽和第1真叶中的POD同工酶表达量高于非转基因玉米。转基因抗矮花叶病玉米和非转基因玉米胚芽和第1真叶中都有CAT-1、CAT-2、CAT-3和CAT-4,转基因玉米较非转基因玉米的4条泳带亮度强。说明转基因玉米胚芽和第1真叶中的CAT同工酶表达量高于非转基因玉米。转基因抗矮花叶病玉米和非转基因玉米胚芽中的SOD共有2条带,分别为SOD-1和SOD-2;两种玉米的2条泳带亮度相近。转基因玉米和非转基因玉米第1真叶中共检测到7条带,分别为SOD-1、SOD-2、SOD-3、SOD-4、SOD-5、SOD-6和SOD-7,转基因玉米中SOD-1、SOD-2、SOD-3和SOD-7都比非转基因玉米的表达量多,SOD-4、SOD-5和SOD-6在两种玉米中表达量相近。

3讨论

本研究通过对转基因抗矮花叶病玉米及其亲本品种的比较,发现转基因玉米与非转基因玉米相比发芽率和发芽势差异不显著,萌发初期淀粉酶、蛋白酶活性、叶绿素含量较高,差异显著。此研究结果与俞超等[13]得出Bt转基因水稻幼苗的生活能力均高于对照的研究结果类似。说明外源基因的导入提高了玉米内源基因的表达活性。生物体的新陈代谢特征可用酶活性和酶浓度表示,50%以上的酶有同工酶催化同一代谢反应。酶活性及同工酶在不同的环境条件下(如在不同底物、pH、温度和不同组织器官)反应速度不同[14]。本试验中,对转抗矮花叶病基因玉米与非转基因玉米进行了比较,发现转基因玉米胚芽中的CAT、POD、SOD的活性与非转基因玉米无显著差异,第1真叶中的CAT、POD、SOD的活性与非转基因玉米差异显著。转基因玉米表达POD、CAT、SOD-1、SOD-2、SOD-3、SOD-7高于非转基因玉米。POD-5只在转基因玉米表达,非转基因玉米(亲本)中未检测到。试验结果表明抗矮花叶病基因的转入改变了玉米同工酶的酶谱。与前期研究转几丁质酶基因玉米的同工酶谱较亲本玉米发生明显差异的结果一致[15]。从时间上看,基因导入能够加大受体基因型变异速率,从而增强其抗逆能力和适应性,使生物体在不同条件下能够正常生长发育[16]。

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