本文作者：赵 敏 汪长国 刘 劲 寇明钰 李 宁 吴 艳 戴 亚 夏庆友 单位：川渝中烟工业公司技术中心 西南大学生物技术学院

植物对病原物的抗性是一个复杂的生命现象，植物通过其细胞预存的和诱导形成的防卫能力产生抗病能力［1-2］。外界植物病原物如细菌、真菌、病毒等均能诱导植物产生主动防御反应。在烟草中，国内外研究者将微生物（如细菌、真菌等）应用于烟叶，以提高烟叶的抗性和品质。Koller等［3］在烟叶中接种微生物以增加香气和改善吸味。English等［4］从发酵烟叶上分离出嗜热细菌，并将这些菌株用于烟叶，可产生香气。赵铭钦等［5］报道了微生物发酵增质剂可提高卷烟香气。马林等［6］用微生物和酶喷施烟叶可降解烟叶中的蛋白质含量，并减少有害气相物质和焦油生成量。谢和等［7］研究发现对烟叶添加微生物，可减少烟叶的青杂气，降低刺激性。汪长国等［8］从烟田土壤中分离筛选出一种芽孢杆菌并制备成微生物制剂（MP制剂），喷施采收前的烟叶能改变烟叶中重要香味成分和蛋白质含量。在此基础上赵敏等［9］研究发现，喷施MP制剂的烟叶组织蛋白酶B基因的表达量高于喷施水的烟叶中组织蛋白酶B基因的表达量，并推测烟叶中组织蛋白酶B基因具有抗菌功能。近年来，蛋白质组学作为后基因组研究中最主要的部分，研究途径之一就是筛选一些目标间的差异蛋白质谱，揭示细胞生理和病理状态的进程与本质、对外界环境刺激的反应途径以及细胞调控机制，同时研究分析某些关键蛋白的功能［10］。本试验利用差异蛋白质组学的研究方法进一步探讨微生物与烟叶间的关系，采用双向电泳技术结合基质辅助激光解析串联飞行时间质谱（MALDITOF/TOFMS），鉴定喷施MP制剂和水的烟叶的差异蛋白，旨在揭示利用MP制剂提高烟叶抗性的分子机制。

1材料与方法

1.1材料与试剂

1.1.1材料喷施烟叶的微生物制剂为巨大芽孢杆菌（MP制剂）［8］，从烟田土壤中分离、筛选。喷施烟叶为实验室智能光照培养箱培养60d的烟草无菌苗，品种为K326。

1.1.2试剂与仪器N，N-甲叉双丙烯酰胺（Bis-acrylamide）、丙烯酰胺（Acrylamide）、Tris、硝酸银购于BBI公司，十二烷基硫酸钠（SDS）、尿素、过硫酸铵、甘氨酸、CHAPS、硫代硫酸钠、高铁氯化钾购于Amresco公司，溴酚蓝、87%（质量分数）甘油、DDT、碘乙酰胺、琼脂糖、四甲基二乙胺（Temed）、IPG胶条（pH3-10，胶条长13cm）、IPGbuffer购于GE公司，TBPReducingAgent购于Bio-RAD公司，甲醇、冰醋酸购于重庆化学试剂厂，乙腈购于Honeywell公司，三氟乙酸、胰蛋白酶、α-氰基-4-羟基肉桂酸购于Sigma公司，碳酸氢铵、甲醛、无水碳酸钠购于上海生物工程公司，蛋白分子marker购于Fermantas公司。HoeferSE600Ruby型垂直电泳仪、EttanIPGphorIII型等电聚焦仪、ImagescannerIII扫描仪（GE公司），4700MALDITOF/TOF质谱分析仪（ABI公司），Milli-Q超纯水系统（美国Millipore公司），DataExplorerV4.5肽质量指纹图谱分析软件，Mascot软件。

1.2方法

1.2.1微生物MP制剂的准备及喷施将MP制剂培养至浓度108CFU/mL，收集部分菌液，剩余菌液低速离心收集菌体和上清液。将制剂菌体和水（对照）2种不同处理（各50mL）分别喷施到培养60d的烟草无菌苗叶面和叶背，喷施后9d取样并在液氮中保存。

1.2.2蛋白质的提取利用三氯乙酸-丙酮沉淀法提取烟叶的蛋白质。先在液氮中研碎烟叶，将粉末悬浮于含DTT（0.2%）的10%三氯醋酸的丙酮溶液中，－20℃沉淀过夜。35000g（6℃）离心30min后，将沉淀重悬于含0.2%DTT的预冷丙酮中，－20℃放置1h，35000g（6℃）离心30min。在通风橱中让丙酮充分挥发，得到干燥的沉淀。在裂解液中重新溶解沉淀，40000g（15℃）离心1h。用Bradford法测定上清液的蛋白浓度，分装后置－80℃保存备用。

1.2.3蛋白质双向电泳第1向等电聚焦采用IPGphorIII等电聚焦仪，选择pH3~10，长13cm的IPG胶条，按照IPGphorIII等电聚焦系统的方法进行实验操作。样品在水化液中水化。吸取250μL样品（含100μg蛋白）的水化液放入标准型胶条槽中，放置好IPG胶条后在胶条上覆盖适量ImmobilineDryStrip覆盖油。设置IPGphorIII仪器运行参数，等点聚焦的程序为：50V水化11h，100V1h，200V1h，500V30min，1000V30min，3000V30min，5000V30min，8000V80000Vhr。各胶条最大电流为50μA。聚焦完毕后采用两步平衡法进行胶条平衡。第一步平衡首先取出含样品的IPG胶条，将其放入装有平衡液中平衡15min。第二步平衡时的平衡液中用1.25%碘乙酰胺代替DTT。最后，将IPG胶条在1倍电泳缓冲液中润洗并沥干，然后放入第2向SDS-PAGE胶中电泳。电泳结束后采用硝酸银染色，并利用ImagescannerIII扫描仪扫描，蛋白斑点的匹配分析利用2-DE图像分析软件ImageMasterTM2DPlatinum6.0。为了提高实验的可靠性，双向电泳实验重复3次。

1.2.4质谱鉴定及数据库查询将喷施MP制剂与水的烟叶蛋白质双向电泳结果中的差异蛋白点挖出后放置于准备好的离心管中，加入脱色液（临用前30mmol/L高铁氯化钾和100mmol/L硫代硫酸钠以1∶1的比例混合）以脱掉胶的颜色。随后用milli-Q水清洗3次，并用适量100%乙腈浸泡，晾干后加入适量胰蛋白酶（浓度为10μg/mL），放置37℃恒温箱中消化20h。酶解后将酶液转入另一套已准备好的管子中，用约25μL的50%ACN/5%TFA浸泡30～60min后，将溶液吸出与酶液合并，随后真空浓缩后用3μL50%ACN/5%TFA重新溶解样品，将样品送入4700MALDITOF/TOF质谱分析仪进行质谱鉴定，并利用Mascot软件和NCBI现有烟草蛋白质数据进行本地化建库检索分析。

2结果与分析

2.1双向电泳凝胶图谱利用双向电泳技术分析喷施MP制剂和水作为对照烟叶中的差异蛋白。采用13cm，pH3~10的胶条对差异蛋白进行分析，经硝酸银染色后得到的双向电泳图谱如图1。在相同条件下，对同一处理的烟叶提取的蛋白进行了3次重复实验。电泳图显示，两种不同处理烟叶的蛋白点的分布较为相似，聚焦效果比较理想，图谱的染色背景浅，蛋白点的形状较为规则，重复性较好。通过图像扫描和分析，可以检测到（200±10）个较为明显的蛋白点，主要分布在pH3~8区域，分子量在15~60kD之间。

2.2烟叶的差异蛋白点分析在喷施MP制剂和水的烟叶蛋白质的双向电泳图谱中，有些蛋白点存在差异，其中选择分辨清楚的差异蛋白点6个，见图2。图2中蛋白点1在喷施水的烟叶中的表达量明显高于喷施MP制剂的烟叶；蛋白点2出现在喷施MP制剂的烟叶图谱中，而在喷施水的烟叶中并没有表达；而蛋白点3，4，5，6在喷施MP制剂的烟叶中表达量明显高于喷施水的烟叶，这些差异蛋白可能对烟叶喷施MP制剂后起到重要作用。为鉴定差异蛋白点的性质，对这6个差异蛋白点进行MALDITOF/TOF分析。鉴定结果显示，蛋白点1，2未鉴定出结果，蛋白点3，4，5，6分别为烟草酸性几丁质酶PR-P（AcidicchitinasePR-PinNicotianatabacum）、烟草几丁质酶前体（EndochitinaseprecursorinNicotianatabacum）、内切几丁质酶A前体（EndochitinaseAprecursor）、逆渗透蛋白（Osmotin）。这些鉴定蛋白的NCBI编号、等电点、理论分子质量和覆盖度见表1。

3小结与讨论

几丁质酶（EC3.2.1.14）是降解几丁质的糖苷酶。研究发现，几丁质酶是主要的植物病程相关蛋白（PR蛋白）之一，与植物的抗病性密切相关。根据几丁质酶前体的氨基酸序列，可将几丁质酶分为5类［11-12］，其中第三类几丁质酶为兼具几丁质酶和溶菌酶的双功能酶，可分解细菌细胞壁的肽聚糖，甚至还可能催化转葡糖基反应，因而可对细菌产生毒害作用。同时几丁质酶还对细胞壁中含有几丁质的真菌有抑制作用，与植物的防疫保护机制有密切关系［13-14］。本试验利用芽孢杆菌制备而成的MP制剂以及水作为对照喷施烟叶后测定烟叶的差异蛋白及其性质。鉴定的差异蛋白之一为几丁质酶。结合几丁质酶在植物中的性质，推测烟叶在受到MP制剂处理后启动了应急机制，促使其几丁质酶表达量增加，进而促进MP制剂中芽孢杆菌细胞壁的肽聚糖分解，同时增强了对真菌的抗性。逆渗透蛋白（Osmotin）是一类植物蛋白，属于植物抵御蛋白PR-5蛋白家族。该蛋白在转基因植物中的表达能抑制真菌病原体数量的增长［15-17］。在烟草上，Osmotin最早由Singh等［18］从烟草细胞培养物中鉴定出，为丰度蛋白。随后的研究也发现该蛋白具有抵抗真菌的活性［19］。本试验通过双向电泳和串联质谱鉴定发现在对烟叶喷施MP制剂后Osmotin的表达量高于喷施水的烟叶。结合Osmotin在植物中的抗真菌功能，推测在喷施MP制剂后烟叶能有效增加抵御外源真菌的能力，进而促使烟叶抗病性的增强。本实验鉴定出的几丁质酶和逆渗透蛋白均与烟草抗性相关。烟叶喷施MP制剂后，几丁质酶和逆渗透蛋白发挥了作用，促使烟叶抵御外源病菌入侵。但MP制剂提高烟叶抗性进而改善烟叶品质的内在机制尚有待进一步研究。

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