孔微量圆底培养板(FluKa公司产品，山东省医科院生化试剂中心提供):C仇孵箱;灭菌标记试管;49型玻璃纤维滤纸:超净工作台;双道FJ一2120液体闪烁计数仪;恒温箱、水浴箱、离心机;微量移液器、微量多头细胞收集器;1m0l玻璃试管及组织研磨器。制备效应细胞:取用药14日的小鼠，挖眼放血，脱颈处死，无菌取脾，在超净工作台中用剪刀将小鼠脾脏剪碎，加入少许基础培养液，移入组织研磨器中，轻轻消瘤方治疗非小细胞肺癌的临床与实验研究研磨制备脾细胞悬液，离心去上清，用Tri--sHN4CI缓冲液在37℃水浴中处理smin，以低渗破坏红细胞，用基础培养液洗3次，每次离心IOmin，转速15ooPrm，最后以完全培养液调整浓度为1x107ml备用。靶细胞的核素标记:取新鲜培养的YAC一细胞(活率>95%)，调整细胞浓度为1x106/ml，将其加入灭菌标记试管中，同时加入3H一TdR一ouei，经37Co、Zh温育，每0.h5震荡1次，标记后的靶细胞用基础培养液洗3次，每次离心10min，转速1500rmP，最后调整细胞浓度为1x10Vml。
　　细胞活性的测定:在96孔圆底培养板中，每孔加1x104/0.lml标记靶细胞，实验组加入1x10丫0.mll效应细胞，取效靶比为100:l，对照组加0.lml培养液，每组5个复孔，置37℃、%5C仇孵箱中温育18h。测定方法:微血管密度(淤D)按照we记ner等的方法及评判标准进行，计算肿瘤内着色的毛细血管和微小血管，即在低倍镜视野下扫视整个肿瘤组织切片，选择最密集的微血管标记区，凡呈现棕黄色标记清晰的单个内皮细胞或内皮细胞串均作为一个可计数的微血管，有较厚肌壁的大血管及管腔面积大于8个红细胞直径的血管不计数，计数方法:先在低倍镜(10x10)视野下扫视整个组织切片，在肿瘤浸润区选择最密集的3个微血管标记区视野，即所谓的“新生血管热点区(hotPsot)s”，然后在相同的背底、背体条件下，以高倍镜(20X20)视野(O.72mnI’)为标准计数所有染色的微血管数，取其均值作为该样本的测定值。然后每张染色切片通过应用一1000高清晰度彩色病理图象分析系统分析软件扫描(电压控制在4.2V0)计算每Zoox视野中积分光密度的定量分析。
　　各组肿瘤病理标本经CD34染色，肿瘤组织间质血管均有着色，以内皮细胞被染成棕黄色为阳性表达，微血管的大小、形态差异较大，有的仅为单个内皮细胞和内皮细胞族，有的官腔不明显或形态不规则，肿瘤边缘组织的MVD高于中央。对照组肿瘤组织内见大量新生毛细血管，阳性目标为位于肿瘤组织及间质呈片状或团块状分布的棕黄色颗粒，各用药组阳性表达细胞颗粒减少。光学显微镜下观察，VEGF阳性染色以肿瘤细胞及其附近的血管内皮细胞浆或胞膜出现棕黄色颗粒为阳性表达。然后每张染色切片通过MPIAS一1000高清晰度彩色病理图象分析系统(电压控制在4.20V)进行光密度(面密度)和强度(灰度测定，经分析软件扫描统计每高倍镜视野下阳性细胞的总面积和平均视觉密度值，视域数:5象数点长:0.832单位:pm统计场总面积:5.2+e005面密度二阳性细胞总面积/统计场总面积。
　　参照韩锐主编套执癌药物研究与实验技术》，，。人肺巨细胞癌细胞系邢细胞石加l接种于含10%小牛血清和1%的青霉素、链霉素R叫n640完全培养液中，℃，5%C氏饱和湿度的C仇培养箱中下培养，细胞贴壁生长，隔日传代一次，传代后接种于DSml培养瓶中，每瓶细胞数5x0l5/ml。细胞生长至3天左右，于倒置相差显微镜下观察细胭长满贴壁，即可传代，在无菌操作台中操作，用吸管吸去培养瓶中的旧培养液，换用新的无菌吸管吸取.02钱胰蛋白酶液撤以刚没过细胞层为度进行消化，静置约1~Zmin，并不时在倒置相差显微镜下观察，当细胞出现小块脱落，细胞界限模糊不清时取新吸管小心吸弃胰蛋白酶液，加入2~3nflpBS液，轻轻转动培养瓶，小心吸弃PBS液，加入完全培养液，用吸管取培养液轻轻吹打瓶壁细胞，使其脱离瓶壁形成单细胞悬液用细胞计数板在显微镜下计数，取实验所需细胞数分装入新培养瓶，添加培养液或实验用药物(血清适量，置于37℃、饱和湿度含溅C仇的C仇细胞培养箱中无菌培养。
　　细胞培养同上，取对数期生长的人肺癌GP细胞，经0.2%5胰酶消化，计数，细胞加入含1%0小牛血清的RPMI1640完全培养液，接种于50ml培养瓶中，每瓶细胞数，置37℃、巩C02饱和湿度的COZ培养箱中培养，培养2h4，至细胞生长旺盛贴壁后，去掉原培养液，分别加入各组不同浓度的含药血清或含DDP的细胞培养液于培养箱中继续培养24h、4h8，(每组设3个复瓶)，经0.2%5胰酶消化后收集细胞，离心5min，0.01mol/LPBS缓冲液洗2次，充分吹打成单细胞悬液，℃、7%0冷乙醇固定1h2以上待测。上机检测前，将GP细胞悬液以1000rm/ni离心，去掉70%乙醇固定剂，PBS液洗涤2次，调整细胞浓度lx10丫ml。

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