本文作者：江涛、滕德强、江天久、吕颂辉、杨维东 单位：暨南大学 、赤潮与水环境研究中心、生物系，广州
溶血毒素(hemolytictoxins)是鱼毒性海洋微藻产生的一类次生代谢产物，是导致鱼类和贝类大量死亡的主要原因之一［1－2］。溶血毒素的致毒作用与洋地黄皂甙(digitonin)相似，作用于血红细胞而使之溶解破裂［3－4］。该毒素对鱼类及水生动物的毒性作用靶器官为鳃，对生物膜的可逆作用引起生物膜通透和泄漏，从而导致鱼类死亡［5］。能够产生溶血毒素且已经造成巨大渔业损失的鱼毒性赤潮藻主要有海洋卡盾藻(Chattonellamarina)、球形棕囊藻(Phaeocystisglobosa)、米氏凯伦藻(Kareniamikmotoi)和多环旋沟藻(Cochlodiniumpolykrikoides)等［6－8］。由于鱼毒性藻类引发的赤潮在世界范围内造成了巨大的经济损失，其产生的溶血毒素逐渐成为海洋学研究的热点。据文献统计，约有30种以上藻类能够产生溶血毒素，主要隶属于甲藻门(Pyrrophyta)、针胞藻门(Rhaphidophyta)、定鞭藻门(Haptophyta)、蓝藻门(Cyanophyta)和硅藻门(Bacillariophyta)［7］。溶血毒素的种类繁多，结构和成分复杂，目前仅对少数藻类产生的溶血毒素研究得比较清楚且确定了化学结构，如小定鞭藻(Prymnesiumparvum)、前沟藻(Amphidiniumsp.)、卡尔藻(Karlodiniumsp.)、环状异帽藻(Heterocapsacircularisquama)、米氏凯伦藻和球形棕囊藻等［9－15］。本文对海洋微藻溶血毒素的类型、理化性质、生物合成和毒性作用进行综述，为今后深入研究海洋微藻溶血毒素和鱼毒性海洋微藻的毒性机制研究提供科学参考。
1产生溶血毒素的藻类
细菌、水螅(Hydra)、水母(Jellyfish)、对虾(Penaeus)和藻类等均能分泌溶血毒素。细菌分泌的溶血毒素是其致病性的重要侵染因子，水螅等腔肠动物分泌的溶血毒素与摄食有密切关系，对虾等甲壳动物分泌的溶血毒素则是重要防护因子，而藻类分泌的溶血毒素是次生代谢产物，能对周围水体中的动植物产生毒害作用，可能是藻类的一种防御机制和生存策略［16－17］。据文献统计，能够产生溶血毒素的藻类有30种，包括甲藻16种，针胞藻5种，定鞭藻4种，蓝藻4种，硅藻1种(表1)，每种藻都可能产生多种溶血毒素［9,18］。
2藻类溶血毒素的类型、结构和性质
溶血毒素的种类繁多，结构和成分复杂。目前仅对少数藻类产生的溶血毒素研究得比较清楚且确定了化学结构(表1)。Kobayashi等1986年从前沟藻(Amphidiniumsp.)中分离出一类大环内酯类溶血毒素，命名为前沟藻毒素(Amphidinolides，图1)。迄今，从前沟藻(Amphidiniumsp.)中报道了38种大环内酯类化合物，其中34种被称为Amphidinolides［9］。这些大环内酯类化合物可划分为32种分子骨架类型，化学结构和毒性特征存在较大差异，但其显著的抗肿瘤活性吸引了药物学家的关注。另外，成功确定溶血毒素化学结构的藻类还包括:小定鞭藻产生的2种小定鞭藻毒素(Prymnesins，图2)［10］和一系列糖脂类化合物［31］;Fibrocapsajaponica产生的3种多不饱和脂肪酸［11］;环状异帽藻产生的2种卟啉衍生物［12］和4种糖脂类溶血毒素［22］;球形棕囊藻产生的溶血毒素，包括3种糖脂类成分［14］;米氏凯伦藻产生的单半乳糖甘油二酯和双半乳糖甘油二酯也具有溶血活性［19］。Place等［37］从剧毒卡尔藻(Karlodiniummicrum=Karlodiniumveneficum，先前称为微小卡罗藻)中分离获得一类具有溶血毒性和细胞毒性的化合物，命名为卡尔藻毒素(Karlotoxins)，有关的检测方法和毒素应用已于2004年获得美国专利，但其化学结构直到2008年才被报道［15］。总的来讲，目前从藻类中分离并鉴定了化学结构的溶血毒素主要为糖脂类、双半乳糖、聚氧多烯聚醚、大环内酯类、卟啉衍生物和多不饱和脂肪酸等化合物。对其他藻类溶血毒素的组成和理化性质也进行了大量研究。自我国东海海域的剧毒卡尔藻分离出的溶血毒素主要含有3种不同性质的组分，其中2种组分分离于总脂提取液，从而推测这2种组分与该藻高含量的多不饱和脂肪酸有关［21,38］。集胞藻(Synechocystissp.)含有蛋白类溶血毒素，分子量约为80kDa，具有热不稳定性［34］。与此相似，从泰氏亚历山大藻(Alexandriumtaylory)中也分离出蛋白类溶血毒素［23］。Onoue和Nozawa率先从海洋卡盾藻中分离出溶血毒素，并测定出其对绵羊血红细胞的溶血活性为0.18HUmg－1［39］。海洋卡盾藻溶血毒素包括多种组分，可能为糖脂和糖类物质，某些组分的溶血活性具有光依赖性，只有在光照条件下才有活性，兔红细胞对该溶血毒素最为敏感［29,40－41］。
3藻类溶血毒素的检测方法
溶血毒素的检测主要是血红细胞溶解测定法(ErythrocyteLysisAssay，ELA)，其原理是基于溶血毒素作用于血红细胞使之溶解破裂，从而通过吸光度的变化来判断溶血毒素是否存在，并与已知浓度的溶血性物质(如洋地黄皂甙)进行比对以确定其溶血能力［1－2,4］。研究表明，温度、pH、金属阳离子、氧化物及某些蛋白类物质等能对藻类溶血毒素的溶血活性产生影响［1,3,42－43］。例如，米氏凯伦藻和球形棕囊藻溶血毒素的溶血活性随温度的升高而增加［3,44］;半胱氨酸盐、过氧化氢和Zn2+等都能提高集胞藻的溶血活性，某些还原剂和金属离子(Ca2+、Mg2+和Cu2+等)则抑制其溶血活性［43］。Ca2+能够显著增强海葵(Stichodactylahelianthus)溶血毒素的溶血活性，而在K+同时存在时这种增强效果骤减［42］;Hg2+对米氏凯伦藻和球形棕囊藻溶血毒素的活性具有很强的抑制作用［3,44］。溶血毒素对不同类型血红细胞的溶血活性也存在差异，如海洋卡盾藻溶血毒素对兔血红细胞的溶解程度明显高于其他动物［41］。由此可以看出，影响溶血毒素活性的因素很多，且没有普遍的规律性。另外，在不同检测波长下所测得的溶血毒素活性也不尽相同［1,24,42］。血红细胞溶解测定法是目前溶血毒素测定最常用的方法，但与其他多数生物检测方法相似，该法仅能够实现溶血毒素的初步定性定量分析，精确度不高，也无法获得具体的化合物信息。ELA法测定溶血毒素的影响因素较多，重现性较差，不同实验室之间缺乏统一的标准和程序，测定结果缺乏可比性。建立化学仪器检测方法是实现溶血毒素准确定性定量的关键。目前国际上只有少数实验室分离纯化了藻类溶血毒素并建立了仪器检测方法，如Place等［37］建立了Karlotoxins的HPLC-MS检测法，实现了对该毒素的定性定量分析。在此基础上，Mooney等［20,45］对不同产地和株系的卡尔藻和其他海洋微藻的Karlotoxins含量和特征进行了研究。由于多数海洋微藻溶血毒素的化学结构尚未确定以及毒素纯品(标准品)缺乏，相关的仪器检测方法不够完善，制约了海洋藻类溶血毒素的深入研究。
4影响海洋微藻溶血毒素合成的因素
海洋微藻溶血毒素的产生机制非常复杂，与其生命周期密切相关。不同产毒藻在不同生长阶段的毒素产量可能存在较大差别，如塔玛亚历山大藻(Alexandriumtamarense)和链状亚历山大藻(Alexandriumcatenella)在对数生长初期和中期麻痹性贝类毒素(PSP)含量最高，随后显著下降，新陈代谢可能是其含量下降的主要原因［46］;而球形棕囊藻和利玛原甲藻(Prorocentrumlima)分别产生的溶血毒素和大田软海绵酸(OA)浓度峰值却出现在平台期或衰亡期，表明这两种藻的产毒机制与Alexandriumsp.不同［4］。Yasumoto［10］认为，藻类毒素的产生可能与自我保护机制有关，随着水体中营养元素不断被消耗，产毒藻在平台期或衰亡期合成能抑制其他竞争生物生长繁殖的次生代谢产物，从而在竞争中处于优势地位。但是，周成旭等［38］对不同生长期剧毒卡尔藻溶血活性的研究表明，该藻在整个生长期都有较高的溶血活性，从而推测溶血毒素是该藻正常的生理代谢产物，并非受到环境胁迫后才合成的次生代谢产物。江涛等［47］对海洋卡盾藻的溶血活性进行了研究，结果表明海洋卡盾藻在对数生长初期的溶血活性最强，溶血活性随培养时间的延长逐渐下降，推测可能是藻细胞毒素的合成速率与细胞的分裂速率不同步有关。环境因素影响溶血毒素的合成。溶血毒素的合成与藻类的生长环境密切相关,当藻类生长受到限制时,溶血毒素的分泌量可能会增大［4,48-53］，但不同限制因素对不同藻类溶血毒素合成的影响并不一致。研究表明，温度对球形棕囊藻溶血毒素合成的影响较为显著，而盐度和光照对其影响则不显著［50］，但盐度能够显著影响海洋卡盾藻和Fibrocapsajaponica的溶血活性［51－52］;水体中高pH和低pH均能增强剧毒卡尔藻的溶血活性，而小定鞭藻对鱼的溶血毒性随水体pH降低而减小［49,53］。水体中营养元素限制也可能促进溶血毒素合成，如N和P限制都能够增强Chrysochromulinapolylepis和小定鞭藻的溶血活性［48］，Fe和N限制对球形棕囊藻溶血活性的影响非常显著［4］;与此相反，Fibrocapsajaponica的溶血活性在N限制下要比非N限制小，其原因可能是由于非N限制下该藻易于聚集从而能够积累溶血毒素［46］。营养元素限制对其他类型藻毒素的合成也存在影响，如P限制下塔玛亚历山大藻麻痹性贝类毒素产量增加，N和P限制下利玛原甲藻和渐尖鳍藻(Dinophysisacuminata)细胞中大田软海绵酸含量增加［54］。值得注意的是，营养元素影响藻毒素合成的化学机理仍不清楚。
5溶血毒素对水生生物的毒性(化感作用)
赤潮藻溶血毒素的产生可能是抑制其它藻类竞争者生长和繁殖的策略(化感作用)［16－17］。当藻类生存环境受到压迫时，为保证自身生存繁殖的需要而产生一种抑制其它竞争生物生长繁殖的物质，即化感物质。溶血毒素可能是鱼毒性赤潮藻产生的一类重要的化感物质［4,16－17,28］。塔玛亚历山大藻滤液对东海原甲藻(Prorocentrumdonghaiense)的生长具有显著的抑制作用，抑制效果与溶血活性的强弱程度一致，而与麻痹性贝类毒素(PSP)的浓度无关，说明溶血毒素可能在塔玛亚历山大藻化感效应中发挥重要作用［55］。研究表明，小定鞭藻在N或P缺乏条件下，其滤液对威氏海链藻(Thalassiosiraweissflogii)、微小原甲藻(Prorocemrumminimum)和波罗的海红胞藻(Rhodomonascf.baltica)的生长均产生抑制作用［56］。但是，在营养充足时，小定鞭藻滤液对这些藻不产生抑制作用。营养盐限制刺激了小定鞭藻毒素(Prymnesins)产量增加，这可能是小定鞭藻滤液能够抑制其他藻类生长的主要原因［56］。另外，许多能够产生溶血毒素的赤潮藻，如Chrysochromulinapolylepis和Kareniamikimotoi等，均显示出对其他藻类生长的抑制作用，但相关的化感物质尚不能确定［28］。溶血毒素对鱼类等水生动物具有明显的毒害作用［49］。溶血毒素作用的部位为鱼类的鳃弓、鳃耙、鳃丝及鳃小片，中毒鱼鳃出现鳃小叶上皮细胞增生、邻近鳃小叶粘连、上皮细胞脱落、鳃血管破裂、血细胞渗出等组织病理现象。鳃小叶在溶血毒素作用下发生病变，影响鱼鳃的呼吸、分泌和排泄等功能，最终造成鱼类的死亡［57－59］。溶血毒素可能是通过改变膜的透性而导致水生动物中毒，其被水生动物吸收后产生直接的致毒效应，或者在阳离子(Ca2+、Mg2+、Zn2+和Cu2+等)存在和适宜的pH条件下对鳃组织造成损伤。小定鞭藻产生的溶血毒素在加入毒素抑制剂(如卵磷脂、胆固醇及脑磷脂等)后，溶血活性显著降低，说明该类溶血毒素和胆固醇等物质竞争相同的靶位［60］。另外，溶血毒素可能还具有多重危害性，如小定鞭藻(P.parvum)所分泌的毒素除了能溶解血红细胞外，还可以对肝细胞、羊膜细胞、腹水细胞以及肿瘤细胞的细胞膜产生作用而使之溶解，因此被认为具有细胞毒性［61］。
6溶血毒素的应用前景
溶血毒素在医药卫生领域具有重要的应用价值。从Amphidiniumsp.中分离的大环内酯类溶血毒素(Amphidinolides)以其独特的大环内酯结构和显著的抗肿瘤活性，吸引了众多药物学家和化学家关注。研究表明，Amphidinolides对小鼠淋巴癌L1210细胞和人类表皮样癌KB细胞表现出很好的细胞毒性(在3μgmL－1下有70%~90%的抑制率)［9］。有些赤潮藻，如Heterocapsacircularisquama，Chattonellamarina和Heterosigmaakashiwo等，产生的溶血毒素具有光依赖性，只有在光照下才具有溶血活性，所以这类溶血毒素可以应用于光敏剂药物的研发［1,12,29］。目前，光敏剂药物已经广泛应用于治疗恶性肿瘤。另外，溶血毒素在抗真菌和病毒方面也有一定的效果［37,62］。总的来讲，溶血毒素种类繁多，结构差异大，生物活性各异，具有很大的药物开发潜力。另外，溶血毒素在海洋环境监测和食品安全领域具有重要的作用。目前，有关海洋微藻溶血毒素对人类健康的影响尚不明确。明确溶血毒素产毒藻种和毒素特征，分离纯化足量溶血毒素纯品并建立精确的定性定量检测方法，实现对鱼毒性赤潮和水产品中溶血毒素的监测，这对保护海洋生态环境安全和人类健康具有重要意义。
7溶血毒素研究中存在的问题
溶血毒素是赤潮藻类分泌的有害毒素之一，但目前人们对其结构和毒性机理的研究还不够深入。当前，鱼毒性赤潮在全球范围内爆发频率不断增加，给养殖业带来很大的损失，甚至导致生态系统的崩溃，已经成为世界各国海水养殖产业的主要威胁之一。但溶血毒素种类很多，不同鱼毒性赤潮藻所产生的溶血毒素结构和性质差异大，溶血毒素含量低，难以获得毒素纯品，尤其是缺少精确的定性定量检测方法，无法有效地对鱼毒性赤潮的毒性进行监测。多数藻类产生的溶血毒素结构未知，无法确定其对水生生物的毒力、毒性和致毒机理，其在食物链中的传递及其对人类健康的危害也不明确。不同生长阶段下鱼毒性藻类溶血活性存在差异，水体中的某些物理化学因素能够影响溶血毒素的合成，这将为鱼毒性海洋微藻的毒性监控提供理论依据。但从已发表的资料来看，有关海洋藻类溶血毒素的检测主要局限于溶血活性分析，而溶血活性无法有效地反映溶血毒素的组成和含量，难以揭示溶血毒素合成与环境因素的关系;溶血毒素的溶血活性和鱼毒性(溶血毒素对鱼类等水生动物的毒性)之间没有必然的相关性，因此根据溶血活性值难以揭示产毒藻对水生动物的毒性［18,63］。从我国海域溶血毒素产毒藻藻华的发生史来看，该类藻华在不同地区或季节爆发时毒性差异很大，如1993和1995年在北黄海近岸、2003和2004年在大亚湾爆发的海洋卡盾藻藻华分别造成大量蛤蜊(Mactrachinensis)和鱼类死亡，而2005年10月和2008年8月分别发生在大亚湾和大连近岸海域的该藻藻华并没有造成明显的鱼类和贝类死亡［64－65］。与此相似，1997年秋至1998年春粤东海域爆发的球形棕囊藻藻华对当地水产养殖业造成很大的经济损失，但2005年春湛江港再次爆发大规模球形棕囊藻藻华，仅造成少量鱼类死亡［7,66］。溶血毒素在藻类毒性作用中起多大的作用?藻类溶血毒素合成受到环境因素的控制程度如何?不同藻株和环境条件下，藻类溶血毒素的化学组成和毒性如何?有关海洋微藻溶血毒素组成、化学结构、合成机制和毒性毒理等方面的研究尚有待于深入研究。
