由大丽轮枝菌（Verticilliumdah1iaeKleb.）引起的棉花黄萎病是世界性的土传病害，也是目前我国棉花生产上危害最严重的病害之一。大丽轮枝菌致病力变异性强，在与寄主协同进化的过程中，由于病菌异核现象和生态环境差异的影响，常出现生理分化[1]。美国Schnathorst和Mathre首先根据不同菌系对棉花致病的严重程度和症状类型，将其划分为落叶型T1（后改为T9）和非落叶型SS4[2]。1983年陆家云等首次报道在我国江苏棉区发现了与美国T9相当的强致病力的落叶型菌系VD8[3]，随后在我国北方棉区和新疆棉区都发现了这种强致病力的菌系[4-5]，这些强致病力落叶型菌系的大量存在是棉花黄萎病严重发生的重要原因之一。江苏省棉花黄萎病菌落叶型菌系自发现后至20世纪90年代初仅发现于南通（位于苏中）和常熟（位于苏南）两地。进入21世纪以后，转基因抗虫棉开始在江苏省大面积推广种植，比例超过80%，并且江苏省棉花种植区域主要集中在苏北，其中盐城市的棉花面积占全省近50%，个别年份近60%。同时棉花黄萎病在江苏省频繁重发，落叶型症状普遍。但近十年来，对江苏省棉花黄萎病菌一直没有进行系统的致病力分化监测。而棉花黄萎病菌致病力分化监测是棉花抗病品种选育和植物检疫的基础工作，本试验的目的是明确目前种植业结构调整以及抗虫棉大面积种植后，江苏省棉花黄萎病菌的致病力分化及分布，为棉花抗黄萎病育种、品种合理布局及棉花黄萎病的综合防治提供依据。

1材料和方法

1.1供试菌株

1.1.1菌株的分离、纯化和保存。于2008年夏季（7－9月）从江苏省各主要植棉区采集棉花黄萎病病株，采用马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基分离各样品中的棉花黄萎病菌。待菌丝长出后，根据菌落形态、分生孢子梗和分生孢子特征鉴定长出的菌落。按稀释平板法从目标菌落获取单孢菌株，同时转移至PDA斜面培养基上25℃培养，待长满后4℃保存以及转移至铺有马铃薯葡萄糖培养液浸过的无菌滤纸片的查氏平板上，25℃培养10d后，将长满菌落的滤纸片放入无菌纸袋中，在无菌工作台上吹干，-70℃保存。共计从江苏省主要棉区的6个地级市（盐城市、徐州市、南通市、连云港市、淮安市和南京市）病秆中分离纯化获得37株棉花黄萎病菌单孢菌株（表1）。

1.1.2参照菌株。落叶型棉花黄萎病菌菌株VD8、V07Df2，非落叶型棉花黄萎病菌菌株Bp2、Df17由江苏省农业科学院植物保护研究所保存。

1.2菌株培养性状观察将各单孢菌株转接在PDA平板上，25℃中培养15d，观察比较各菌株固体培养的菌落形态。将各单孢菌株在PDA平板上25℃培养15d后，用直径为0.7cm的打孔器取菌饼5块，置于装有300mL查氏液体培养基的1000mL三角瓶中，同时加入少量氯霉素抑制细菌生长，25℃中振荡培养15d，观察各菌株液体培养性状。

1.3特异性引物PCR检测菌株致病类型将各供试菌株在查氏液体培养基中25℃振荡培养10d后，过滤获得菌丝体，液氮冷冻后研磨成细粉，按照Raeder和Broda[6]的方法提取菌丝体的DNA。选用Pérez-ArtésE等[7]设计的特异性引物D-1（5′-CATGTTGCTCTGTTGACTGG-3′）、D-2（5′-GACACGGTATCTTTGCTGAA-3′）用于检测棉花黄萎病菌落叶型菌系，扩增产物大小为0.55kb；ND-1(5′-CAGGGGATACTGGTACGAGACG-3′)、ND-2（5′-ATGAGTATTGCCGATAAGAACA-3′）用于检测棉花黄萎病菌非落叶型菌系，扩增产物大小为1.5kb。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。PCR反应体系和条件按照Pérez-ArtésE等[7]的方法进行。

1.4菌株的苗期致病力测定选用4个对棉花黄萎病具有不同抗性的棉花品种作为鉴别寄主，分别为中棉石系亚、中植棉2号、冀668和泗棉3号。前2个品种由中国农业科学院植物保护研究所简桂良研究员提供，后2个品种由江苏省农业科学院经济作物研究所陈旭升研究员提供。温室条件下，将催芽后的脱绒棉种播到装有灭菌土的营养纸钵中，每菌株4个鉴别寄主，每个鉴别寄主播15钵，作为3次重复，即每个菌株鉴别寄主60钵，待棉苗出土后每钵留苗1～2株。将各单孢菌株在查氏液体培养基中25℃振荡培养15d后，用4层纱布过滤，制成孢子悬浮液，在显微镜下用血球计数板计数将浓度调到1.0×107mL-1，现配现用，供接种用。当棉苗长出1～2片真叶时，参考石磊岩的方法即纸钵撕底蘸根法进行伤根接种[4]，每钵棉苗接种10mL孢子液。在棉株接菌后的第15天、20天、25天、30天分别调查各处理的发病率、病级，观察症状类型，按全国统一病情分级标准进行分级调查，记载病情[4]。并以接菌后第30天调查的结果计算出病情指数，划分品种的抗病类型，划分标准为：病情指数0.0，免疫（I）；病情指数0.1~10.0，高抗（HR）；病情指数10.1～20.0，抗病（R）；病情指数20.1～35.0，耐病（T）；病情指数35.0以上，感病（S）。采用DPS统计软件包处理数据[8]，用Duncan新复极差法做多重比较。为保证各菌株致病力之间的可比性，苗期致病力测定试验在同一批完成。

2结果与分析

2.1江苏省棉花黄萎病菌的培养性状根据各单孢菌株在PDA培养基上的菌落特征可将供试棉花黄萎病菌分为3种类型，即：菌核型（VH）、菌丝型（VS）和中间型（VM）[9]。菌核型表现为产生大量黑色菌核，菌丝型表现为产生旺盛的白色或浅黄色菌丝，中间型产生少量菌核。供试的37个单孢菌株中有20个属于菌核型，占54.1%；9个属于菌丝型，占24.3%；8个属于中间型，占21.6%。各菌株的培养类型见表1。值得注意的是在所分离的菌株中出现初分离培养时完全为黑色微菌核的菌膜菌核型菌落（图1），具这种新培养菌落特征的棉花黄萎病菌为首次发现报道。另外，棉花黄萎病菌的液体培养性状与固体培养性状很相似，即在平板上产生微菌核的菌核型菌株培养液颜色为黑色；不产生菌核的菌丝型菌株，培养液的颜色则呈淡黄色。

2.2特异性引物PCR检测江苏省棉花黄萎病菌的致病类型用引物D-1/D-2、ND-1/ND-2PCR检测37个江苏2008年分离的单孢菌株和4个参照菌株的致病类型，结果只有6个江苏单孢菌株V08Sy-2、V08Sy-3-3、V08Sy-4-2、V08Df-4-2、V08Df-6-2、V08Pz-1和2个参照的非落叶型菌株Bp2、Df17由非落叶型菌系的特异性引物ND-1/ND-2PCR扩增出大小为1.5kb的目的条带（图2）。而其余31个江苏单孢菌株和2个参照的落叶型菌株VD8、V07Df2则由落叶型菌系的特异性引物D-1/D-2PCR扩增出大小为0.55kb的目的条带（图3）。表明：37个江苏单孢菌株中非落叶型菌株6个，占16.2%；落叶型菌株31个，占83.8%。目前江苏省棉花黄萎病菌以落叶型菌株为主，并且在6个地级市中均有分布（表1）。2.3不同地区棉花黄萎病菌的苗期致病力测定采用纸钵撕底蘸根法苗期接种中棉石系亚、中植棉2号、冀668和泗棉3号4个棉花品种，一般接种后15d开始发病，30d左右达到发病高峰。对苗期致病力结果（表1）作方差分析，结果表明各品种之间、菌株之间整体存在显著差异。从多重比较结果也可以看出品种之间的变异大于品种内的变异，菌株之间的变异大于菌株内的变异。综合37个黄萎病菌菌株对4个棉花品种的病情指数分析表明，泗棉3号最感病，冀668和中植棉2号次之，中棉石系亚最抗病。菌株致病力强弱主要表现在导致寄主发病程度的轻重上，据致病力测定结果，将37个江苏单孢菌株划分成致病力强、中、弱3类。其中强致病力的10个菌株，占供试菌株的27.0%，泗棉3号和冀668表现为感病或者泗棉3号表现为感病，其余品种表现为耐病；中等致病力的15个菌株，占供试菌株的40.5%，泗棉3号表现为感病，其余品种至少有1个品种表现为抗病；弱致病力的12个菌株，占供试菌株的32.4%，没有品种表现为感病。具体每个菌株的致病力测定结果见表1。菌株V08Sy-3-3、V08Sy-4-3的致病力最强，而V08Sy-3-2、V08Sy-6、V08Df-4-3的致病力最弱。试验结果还表明无论是落叶型群体还是非落叶型群体中，都存在致病力强、中、弱的菌株。

3讨论

国内外研究认为，棉花黄萎病菌的形态和致病力变异很大。在20世纪90年代初宋晓轩等研究发现棉花黄萎病菌出现了菌丝型这种新类型，其致病力强，田间致病类型为早期落叶型[9]。20世纪90年代这一时期河南安阳菌系正逐渐由菌核型向菌丝型转化，菌丝型菌株在田间所占比例越来越高[10]。江苏2002年分离的44个棉花黄萎病菌菌株，也是以菌丝型为主，占45.5%，其次为中间型，菌核型最少[1]，与河南安阳菌系的演替趋势一致。而2008年江苏省分离的37个棉花黄萎病菌单孢菌株则是以菌核型为主，占54.1%；菌丝型和中间型所占比例较小，分别为24.3%和21.6%，显示江苏省的菌株正在从菌丝型为主演变为菌核型为主，这一现象非常值得关注。从全国范围内看，2005年以后调查的数据显示，河南、陕西、新疆等地的棉花黄萎病菌也都是以菌核型为主[5,11-12]，表明菌核型正在回归成为优势种群。菌核型虽然表现为产生大量黑色菌核，但大多数菌落的中央为白色棉絮状的菌丝而较凸起，再靠中间为黑色的菌核，外围边为灰白色的菌丝，国内资料记载黑色素所占比例最高为90%[12-13]。本文首次报道发现在初分离培养时，菌落为完全黑色微菌核的菌膜菌核型棉花黄萎病菌菌株，表明棉花黄萎病菌培养特性的变异程度正逐渐加大，呈现为完全产黑色微菌核、部分产黑色微菌核和完全不产黑色微菌核的菌落特征。研究棉花黄萎病菌的致病类型多采用传统的营养体亲和性测定，但近年来随着分子生物学的发展，通过限制性片段长度多态性分析技术Restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP）和随机引物扩增多态性分析（Randomamplifica-tionofpolymorphicDNA,RAPD）等技术，筛选到棉花黄萎病菌落叶型菌系和非落叶型菌系的特征性条带，设计出特异性引物，能够快速检测出落叶型和非落叶型。其中Pérez-ArtésE等[7]设计的特异性引物D-1/D-2和ND-1/ND-2被广泛用于落叶型和非落叶型黄萎病菌的分子检测，得到国内外同行的认可[5,14-16]。本文利用上述特异性引物PCR(Polymerasechainreaction)检测2008年分离的江苏省棉花黄萎病菌的致病类型，落叶型菌株占83.8%，从分子水平上证实了落叶型菌株已经成为当前江苏省棉花黄萎病菌的优势种群，并且遍布江苏各主要植棉区。对江苏省黄萎病菌苗期致病力测定结果表明，江苏各地黄萎病菌菌株致病力之间存在较大差异，且大多数以强致病力和中等致病力菌株为主，都可使泗棉3号表现为感病，占供试菌株的67.5%，显示江苏省棉花黄萎病菌的致病力较强。结果还表明棉花黄萎病菌的致病力分化严重，无论是按照培养类型划分，还是按照致病类型划分，菌核型、菌丝型、中间型、落叶型、非落叶型都是一个个群体，在每一个群体内部的菌株又都存在致病力分化。因此，很难简单地根据培养类型或致病类型来判定某一菌株的致病力强弱。同时需要指出的是对于分子检测出的棉花黄萎病菌的致病类型还需要进一步通过接种鉴定来验证，但目前还没有温室苗期致病力测定落叶型菌株的划分标准。我们通过比较分子鉴定出的落叶型菌株和非落叶型菌株接种棉苗发病落叶的情况，发现2种致病类型的菌株接种后都可产生落叶症状，但落叶的程度有明显的差别。同一棉花品种如果接种落叶型菌株，其落叶症状往往比接种非落叶型菌株重。在感病品种上落叶症状比较明显，常表现全部落叶或部分落叶，而在抗病品种上，落叶症状则很少或仅部分落叶。因此，落叶症状的轻重不仅与菌株的致病类型有关，而且与棉花品种的抗病性有关。因此，需要寻找一套能区分落叶型菌株和非落叶型菌株的鉴别寄主，建立菌株致病类型的鉴定标准。另外，本文从同一块地的病样中同时分离出的菌株表现出不同的致病力，并且培养特性和致病类型也有差异。比如本文共有5块地中分离出多个菌株，其中V08Sy-1-1、V08Sy-1-2培养类型分别属于菌核型和菌丝型，致病类型都为落叶型，致病力都为弱；V08Sy-3-1、V08Sy-3-2、V08Sy-3-3培养类型分别属于菌核型、菌丝型和中间型，致病类型分别为落叶型、落叶型和非落叶型，致病力分别为中、弱、强。已有研究通过鉴别寄主苗期致病力测定，表明同一棉田黄萎病菌的致病力类型是多样的，存在落叶型和非落叶型2类病害表现类型，致病力也存在强、中、弱3种类型，是一个由弱到强连续变化的群体[17]。本文再次证实同一棉田确实存在多种致病力的黄萎病菌菌株，并且首次通过特异性引物PCR检测的方法在分子水平上证实同一棉田同时存在落叶型菌株和非落叶型菌株。

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