侧线系统是皮肤衍生的感觉器官,为鱼类和水生两栖类所特有,在鱼类的摄食、御敌、生殖、洄游等行为中发挥重要作用(Baker&Bronner-Fraser,2001;Gouletetal,2008;Mogdans&Geisen,2009;Wilkens&Hofmann,2007)。它由机械感受器和电感受器组成。机械感受器能感受水流、水压的变化；电感受器能检测周边微弱电场变化(Chengetal,1995;Northcutt,1992;Songetal,1995)。不同于机械感受器,电感受器在硬骨鱼类中经历了二次进化,如部分辐鳍亚纲鱼类(多鳍鱼和鲟鳇鱼等)存在与软骨鱼类相似的壶腹型电感受器；而新鳍亚纲中的雀鳝目、弓鳍鱼目电感受器缺失,仅存在机械感受器。在部分现代真骨鱼(骨舌鱼类和个别鲶鱼等)中又出现了结节状电感受器,但电感受器的进化历程,尚未完全了解(Gibbs,2004;O'Neilletal,2007)。鲟鱼是软骨硬鳞下纲中现存的唯一一目,素有“活化石”之称(Ma,2007;Wangetal,2009)。它是少数具有壶腹型电感受器的硬骨鱼类之一,在电感受器进化中占据极为重要的地位(Gibbs&Northcutt,2004;Hofmannetal,2002;Songetal,2010)。西伯利亚鲟(AcipenserbaeriiBrandt)隶属鲟形目(Acipenseriformes)鲟科(Acipenseridae)鲟属(Acipenser),主要分布于俄罗斯西部的鄂毕河至东部的科雷马河之间的各河流中(Gisbert&Williot,2002)。西伯利亚鲟头部具较为丰富的电感受器(Gibertetal,1999),且适应性广、生长速度快、具有抗病能力,现已成为我国淡水养殖的优良品种(Lin,2003)。近年来,有关西伯利亚鲟的研究已有不少,在早期发育方面,对其早期行为学、眼睛发育已进行了较系统的研究(Gisbert&Ruban,2003;Rodríguez&Gisbert,2002),而侧线系统发育相关研究尚未见报道。本研究从形态学和组织学角度,应用光镜和扫描电镜研究西伯利亚鲟侧线系统早期发育,不仅对研究电感受器的起源与进化有着重要意义,而且为人工育苗积累基础资料。1材料与方法1.1实验材料西伯利亚鲟受精卵为杭州千岛湖鲟龙科技开发有限公司全人工繁殖所得子二代(F2)卵。受精卵在实验室经人工孵化,孵化温度控制在(18±0.7)℃。出膜后的仔鱼置于35cm(长)×21cm(宽)的塑料水族箱中饲养,水深保持15cm。实验用水需经充分曝气,用加热棒控温。开口饵料为水蚯蚓,进入稚鱼阶段后投喂颗粒饲料。实验过程中每天投喂2次,排污和换水各1次,每次换水量为水体的1/4。1.2实验方法记载鱼苗出膜高峰期当天为0日龄。早期仔鱼阶段每24h取材1次;晚期仔鱼和稚鱼阶段,每48h取材1次。每阶段取材10尾,立即用3-氨基苯甲酸乙酯甲基磺酸盐(MS-222)麻醉,其中5尾经Bouin氏液固定后,按照常规组织学方法制作石蜡切片,作连续切片(厚度5～7μm),H.E.染色,中性树胶封片,Olympus显微镜下观察并拍照。另外5尾,经2.5%戊二醛和1%锇酸双重固定,梯度酒精脱水,醋酸异戊酯取代,临界点干燥,喷金,JEOL-6390LV扫描电镜观察并拍照。

2结果与分析西伯利亚鲟侧线系统早期发育过程主要包括侧线基板发育及感觉嵴的形成、侧线感受器的发育以及侧线管道的形成。

2.1侧线基板发育及感觉嵴的形成1日龄,刚出膜的仔鱼头部较小,弯向卵黄囊;嗅囊呈椭圆形,触须原基和鳃原基形成(图1A)。在听囊前后外胚层

增厚区域出现6对侧线基板。听囊前有3对分布,分别为前背侧基板、前腹侧基板、听侧线基板;听囊后的3对分别为中间基板、横枕基板和后侧线基板(图1B)。侧线基板成神经细胞形成(图2A,B)。前背侧基板、前腹侧基板、听侧线基板、中间基板、横枕基板开始延长形成过渡性结构—感觉嵴,神经丘原基在所有的感觉嵴上形成,并且在听侧线基板感觉嵴中央区域已有3个神经丘出现(图2C);后侧线基板没有形成感觉嵴结构,而是开始向躯干部迁移,在躯干部特定的位置遗留下部分细胞,这群细胞最终将发育成为神经丘(图2D)。5日龄,仔鱼头部抬起并伸长,嗅囊中间内侧靠拢,呈“哑铃状”,鳃丝外露,触须增长,呈圆柱状(图1C)。前背侧基板感觉嵴分别向眶上和眶下延伸,形成眶上感觉嵴和眶下感觉嵴。眶上感觉嵴出现4个神经丘；眶下感觉嵴出现1个神经丘。前腹侧基板感觉嵴向背部略有延长。听侧线基板感觉嵴和中间感觉嵴在同一直线上,听侧线基板出现4个神经丘,中间基板出现1个神经丘;横枕感觉嵴向背部的中线迁移,出现1个神经丘;后侧线基板已迁移至胸鳍后端,并有5个神经丘形成;此外,在中间陷器线和后陷器线的位置有1个神经丘出现;壶腹器官原基在前背侧基板中形成(图1C,D)。9日龄,仔鱼头部扁平,鼻孔中间缝合,形成前后两鼻孔,口呈水平位(图1E),此时仔鱼开始营底栖生活,营养从内源向外源转换,仔鱼各器官快速发育。眶上感觉嵴和眶下感觉嵴的后端连接处已与听侧线基板感觉嵴相连接。中间基板感觉嵴向前后轴伸长,前端与听基板感觉嵴融合,后端与横枕基板感觉嵴、后侧线基板融合,此时侧线管道开始形成。神经丘在所有感觉嵴中央出现,其中眶上管10个,眶下管17个,听管4个,颞管2个,横枕管3个。后侧线基板已迁移至尾部。壶腹器官在前背侧基板、前腹侧基板、听基板、横枕基板中出现,并且在前背侧基板中有少数壶腹器官发育完全(图1E,F)。

2.2侧线感受器的发育

2.2.1神经丘的发育扫描电镜下,0日龄,神经丘在听侧线基板感觉嵴中出现,呈椭圆形,外层为套细胞,形成椭圆形带,中央可见2～3束感觉毛细胞的纤毛延伸突出于神经丘表面(图3A)。5日龄,神经丘呈椭圆形凹陷,凹陷周围由套细胞的延伸组成,感觉毛细胞的纤毛束数量增多,并且延长突向表面,因黏液的分泌使纤毛黏成多束(图3B)。29日龄,神经丘表面胶质覆盖物形成,毛细胞和支持细胞继续生长,毛细胞和支持细胞的数量也不断增加。49日龄,神经丘呈长椭圆形,长径约47μm,短径约20μm;神经丘中央形成由约22个毛细胞组成的感觉极性区域,每一个毛细胞均有一根动纤毛和数根静纤毛,动纤毛总是位于细胞的一侧,静纤毛群侧位于另一侧且排列成排,使得细胞具有极性，其周围由大量的支持细胞和套细胞组成(图3C)。此时,部分神经丘正被管道覆盖(图3D)。52日龄,神经丘已完全被骨化的管道所包埋,并且在侧线管内有规律地按一定距离分布。

2.2.2壶腹器官的发育7日龄,感觉上皮开始下陷,含少量感觉细胞和支持细胞,形状不规则,染色较浅(图4A)。9日龄,感觉上皮下陷明显,感觉细胞和支持细胞数量增加,感觉细胞核染色较深(图4B)。29日龄,壶腹器官在表皮开口的宽度以及下陷的深度明显增加,感觉细胞和支持细胞数量继续增加。在吻部腹面两侧可见少数个别的壶腹器官表皮细胞覆盖壶腹器官中央区域留下3～4个小的开口(图5)。36日龄,感觉上皮继续下陷,感觉细胞数量较支持细胞多,排列紧密(图4C)。57日龄,大部分壶腹器官发育成熟,呈长颈瓶状,瓶结构内部充满黏液,瓶口开口于皮肤表皮,与外环境相接触,瓶的底部埋在真皮层内,感觉细胞和支持细胞位于瓶底内部,感觉细胞呈卵圆形,围腔排列,球形的细胞核染色较深；支持细胞位于底部基膜之上,细胞质延伸通向腔内,将感觉细胞隔开(图4D)。大部分壶腹器官分布在神经丘两侧(图4E),也有单侧分布,例如它们只单侧存在于听侧线管背部。鳃盖处壶腹器官除外,鳃盖处未发现神经丘的存在。扫描电镜下,7日龄,壶腹器官原基已在前背侧基板、前腹侧基板、听基板、横枕基板中形成(图6A)。9日龄,壶腹器官主要分布在吻部腹面两侧(图6B),并且出现单个发育完善的壶腹器官,吻部两侧及背面、鳃盖等处陆续有壶腹器官原基形成。15日龄,吻部腹面中央壶腹器官表皮开口增多(图6C),从开口处可见管内有大量的黏液物质存在。有少量壶腹器官在吻部两侧及背面、鳃盖等处出现。29日龄,壶腹器官布满整个吻部腹面(图6D),从壶腹器官表皮开口可见管底有大量微绒毛分布(图6E)。36日龄,吻部腹面开始出现多个壶腹器官聚集成簇,初具“梅花状”。57日龄,吻部腹面可见3～4个壶腹器官聚集在一起,呈“梅花状”,分布紧密,并且该部分皮肤表面凹陷,形成花朵状凹穴(图6F)。

2.3侧线管道的形成头部侧线管道的形成。9日龄,管道神经丘全部出现在皮肤表面,神经丘及神经丘之间的表皮略有凹陷,侧线管道开始形成(图7A)。15日龄,管道上皮继续下陷,呈沟状,形成开放式管道(图7B)。36日龄,管道下陷明显,周围有软骨组织生成(图7C)。49日龄,管道底部变宽,神经丘位于底部中间,管道上方开始闭合(图7D)。52日龄,侧线管道完全封闭,并被软骨包围,近圆形,周围有少量黑色色素分布(图7E)。眶上管、听管、颞管、横枕管形成较眶下管略早些。随着仔鱼的生长,侧线管道直径不断增大。躯干侧线管道与头部管道发育相似(图8),躯干侧线管道直径比头部要小。57日龄,侧骨板发育完全,躯干侧线管道已完全埋于侧骨板中,并且被软骨包围(图8E),在每一骨板鳞片上均有一小孔与外界相连。

3讨论

从胚胎发育的观点看,神经系统的组成成分主要来源于神经胚的两部分：神经嵴和外胚层板。神经嵴起源于神经管最靠背部的区域,能迁移至身体不同部位,产生各种类型分化细胞,主要包括感觉交感和副交感神经系统的神经元和胶质细胞、肾上腺的髓质细胞、表皮中的黑色素细胞,以及头部的骨骼和结缔组织成分(Baker,2008;Dupinetal,2007);外胚层板是由胚胎头部特定区域的外胚层增厚单独形成的,能发育形成各种感觉细胞及其神经节,主要包括嗅基板、听基板、三叉基板、深基板及侧线基板等(Bakeretal,2008;Schlosser,2006,2008)。Northcuttetal(1995)运用组织嫁接和组织切除等实验手段,证实蝾螈侧线系统由侧线基板发育而来;侧线基板分布在在耳部前后外胚层增厚区域;神经丘在侧线基板的中央区域形成,壶腹器官在侧线基板的两侧区域形成。O'Neilletal(2007)从分子生物学方面在小点猫鲨(Scyliorhinuscanicula)中,证明转录辅助因子Eya4能在侧线系统发育的整个过程中表达,包括在所有的侧线基板中和感觉嵴阶段;而壶腹器官是在感觉嵴阶段形成,证明了鲨鱼的电感受器起源于侧线基板，并且发现转录因子Tbx3是鲨鱼侧线神经系统的特定标记。本文研究表明,西伯利亚鲟仔鱼听囊前后外胚层增厚区域存在6对侧线基板,除后侧线基板细胞向躯干迁移外,其他侧线基板都形成一短暂性存在的感觉嵴结构;神经丘在感觉嵴的中央区域形成,壶腹器官在感觉嵴的两侧形成;壶腹器官的发育比神经丘晚一周左右,这与蝾螈侧线发育模式相似(Northcuttetal,1994,1995)。目前有学者通过研究认为神经嵴细胞也参与的侧线系统的发育,比如Collazoetal(1994)运用胚胎预定命运图绘制技术,研究表明斑马鱼、条鳍鱼、蝾螈侧线系统具有双重起源,既起源于外胚层板，又起源于神经嵴,但是由于在神经胚期神经嵴细胞和外胚层板细胞混合在一起,通过向胚胎注射DiI难以区分细胞的种类。基于电感受器中基因Sox8和HNK1抗体的交叉反应,Freitasetal(2006)认为鲨鱼的电感受器起源于神经嵴细胞,但是该实验所用都不是神经嵴细胞特定的标记物。本研究通过组织学和扫描电镜观察,为西伯利亚鲟侧线发育的研究提供形态学方面证据。为进一步认识侧线发育过程,需要运用分子生物学和细胞生物学等手段,对侧线发育相关功能基因表达及细胞迁移等进行研究。

前腹侧基板一般能发育形成前鳃盖下颌管。密西西比铲鲟的前腹侧基板虽没有形成管道结构,但在鳃盖处出现5个神经丘(Gibbs&Northcutt,2004)。在西伯利亚鲟中前腹侧基板仅发现有少量的壶腹器官,没有神经丘的结构出现。壶腹器官一般在神经丘的两侧都有分布(Northcuttetal,1994),在西伯利亚鲟及其他鲟科鱼类中,听侧线管的腹侧没有壶腹器官分布,仅在其背侧有壶腹器官分布(Gibbs&Northcutt,2004)。这些发育特点差异性可能与个体及其生存环境适应性有关,也可能是侧线系统进化的表现。29日龄,在吻部腹面两侧可见少数个别的壶腹器官表皮细胞覆盖壶腹器官中央区域留下3～4个小的开口。壶腹器官表皮细胞这种特殊的迁移尚未在国内外相关研究文献报道。壶腹管内可见大量的微绒毛存在,在其他鲟形目鱼类、多鳍鱼、软骨鱼类中也存在类似的结构(Camachoetal,2007)。在我国,虽然西伯利亚鲟已突破了全季节全人工催产和人工受精技术(Zhuangetal,2009),但是仔鱼培育阶段必要时候仍需要使用加热装置进行控温,一般在小水体中常使用加热棒控温,加热棒一般分为铜加热棒和玻璃加热棒两种,由于鲟鱼类壶腹器官能检测水环境下周边微弱电流,对金属极为敏感,产生逃避行为(Gurgensetal,2000;Teeteretal,1980)。西伯利亚鲟仔鱼在9日龄初次摄食阶段已有壶腹器官发育成熟,用铜加热棒可能会使西伯利亚鲟出现慌乱逃窜行为,影响其摄食及正常生长,并导致大批量死亡。

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