本文作者：郭志强 杨奉珠 雷 岷 宋代军 谢晓红 单位：四川省畜牧科学研究院 西南大学动物科技学院
众所周知，抗生素的发现和应用为畜牧业的发展做出了巨大的贡献。然而，随着抗生素的滥用，抗生素在畜产品中的残留、耐药性以及环境污染等负面问题日益严重，引发了国家对饲料、食品、环境安全的极大关注。为此，许多国家和地区对一些抗生素作为饲料添加剂作了明确的禁止，如欧盟在2006年开始禁止抗生素在动物饲料中的应用［1］。因此，寻找无毒、无害、高效、安全的抗生素替代品成为动物营养界的研究热点之一。抗菌肽(antibacterialpeptides，ABPs)是生物体内经诱导产生的一种具有生物活性的小分子多肽，相对分子质量在2000～7000，由20～60个氨基酸残基组成。这类活性多肽多数具有相对分子质量小，稳定性、水溶性好以及广谱抗菌，对高等动物细胞几乎无害，体内无残留等特点［2－4］。由于抗菌肽作用机制缺乏特异性，且与抗生素类不易产生交叉耐药性［5－7］，所以在正常使用量下不会出现药残及耐药菌株的出现，是理想的抗生素替代品之一。抗菌肽最早是在1972年由瑞典科学家Boman［8］在果蝇上发现的，而真正意义上的抗菌肽是由Steiner等［9］经注射阴沟通杆菌及大肠杆菌诱导惜古比天蚕蛹产生的具有抗菌活性的多肽，定名为天蚕素(cecropins)。体外抑菌试验已证明抗菌肽能有效抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌等有害菌增殖，而且不易产生耐药性，同时能提高动物机体的免疫力，是替代抗生素的较好选择之一［10－11］。目前，抗菌肽的应用效果在猪［1］、鸡［12－13］等动物上已经得到证实。本试验拟通过在新西兰肉兔饲粮中添加抗菌肽，研究抗菌肽对肉兔小肠黏膜形态、盲肠菌群和免疫功能的影响，为其进一步推广应用提供理论依据。
1材料与方法
1．1试验材料试验用抗菌肽由国家饲料工程技术研究中心研制，北京中农颖泰生物科技有限公司生产，纯度≥90%，含天蚕素200万单位/g。
1．2试验设计选取体重相近的35日龄断奶的新西兰肉兔160只，随机分为5组，每组4个重复，每个重复8只(公母各占1/2)。参照NRC(1977)［14］肉兔营养需要，结合新西兰肉兔生长发育特点以及本地区饲料资源状况设计基础饲粮。基础饲粮组成及营养水平见表1。对照组饲喂基础饲粮，试验组分别饲喂在基础饲粮中添加30mg/kg喹乙醇以及150、200和250mg/kg抗菌肽的试验饲粮。
1．3饲养管理试验从35日龄开始，正试期8周。试验前对兔舍进行充分冲洗和严格消毒。试验兔自由饮水，自由采食，定期打扫兔舍，常规免疫接种。
1．4指标测定及方法1．4．1小肠黏膜形态的测定试验结束后，每组屠宰6只试验兔，分别截取十二指肠、空肠和回肠中段2cm组织，用生理盐水冲洗后迅速放入预先配制好的福尔马林溶液中固定。按常规方法制作石蜡切片，苏木精－伊红染色，按照Sun等［15］的方法测定绒毛高度和隐窝深度。1．4．2盲肠菌群的测定采集屠宰试验兔盲肠食糜，用平板培养法测定其大肠杆菌、乳酸杆菌、双歧杆菌以及总好氧菌和总厌氧菌数量，用1g肠道内容物中细菌数量的对数［lg(CFU/g)］表示。大肠杆菌采用伊红美蓝培养基培养，乳酸杆菌采用乳酸细菌(MRS)培养基培养，双歧杆菌采用MRS+5－溴－4－氯－3－吲哚－β－D－半乳糖苷(X-Gal)培养基培养，总好氧菌采用大豆琼脂培养基培养，总厌氧菌采用厌氧血琼脂(CDC)培养基培养。1．4．3血清免疫指标的测定试验结束后，每组选取6只试验兔，心脏采血，将采集的血液注入5mL的离心管中，3000r/min离心5min，将上清液转移至新的离心管中，于－20℃冰箱中保存。采用免疫透射比浊法测定血清中免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白M(IgM)、补体3(C3)、补体4(C4)含量。1．5数据处理与分析试验数据用Excel2003软件进行处理后，采用SPSS14．0统计软件进行方差分析，Duncan氏法进行多重比较，以P＜0．05为差异显著性判断标准，结果用“平均值±标准差”表示。
2结果
2．1抗菌肽对肉兔小肠黏膜形态的影响由表2可知，抗菌肽和喹乙醇对十二指肠绒毛高度无显著影响(P＞0．05);各抗菌肽组的空肠绒毛高度显著高于对照组和喹乙醇组(P＜0．05)，但各抗菌肽组之间差异不显著(P＞0．05);150、250mg/kg抗菌肽组的回肠绒毛高度与对照组相比显著增加(P＜0．05)，但与喹乙醇组及200mg/kg抗菌肽组差异不显著(P＞0．05)。200mg/kg抗菌肽组的十二指肠隐窝深度最低，显著低于对照组、喹乙醇组和150mg/kg抗菌肽组(P＜0．05)，但与250mg/kg抗菌肽组差异不显著(P＞0．05);与对照组相比，喹乙醇组和各抗菌肽组的空肠隐窝深度均显著降低(P＜0．05)，同时200和250mg/kg抗菌肽组还显著低于喹乙醇组和150mg/kg抗菌肽组(P＜0．05);喹乙醇组及200、250mg/kg抗菌肽组的回肠隐窝深度显著低于对照组和150mg/kg抗菌肽组(P＜0．05)，其他组之间差异不显著(P＞0．05)。喹乙醇组和各抗菌肽组的十二指肠、空肠以及回肠绒毛高度与隐窝深度的比值(V/C)均显著高于对照组(P＜0．05)。此外，十二指肠绒毛高度与隐窝深度的比值还表现出200和250mg/kg抗菌肽组显著高于喹乙醇组和150mg/kg抗菌肽组(P＜0．05)，200mg/kg抗菌肽组显著高于250mg/kg抗菌肽组(P＜0．05);空肠绒毛高度与隐窝深度的比值还表现出200和250mg/kg抗菌肽组显著高于喹乙醇组(P＜0．05)，250mg/kg抗菌肽组显著高于150mg/kg抗菌肽组(P＜0．05)。
2．2抗菌肽对肉兔盲肠菌群的影响由表3可知，喹乙醇和抗菌肽均可显著降低总好氧菌数量(P＜0．05)，其中以200mg/kg抗菌肽组最低，显著低于其他各组(P＜0．05);与对照组相比，喹乙醇组和各抗菌肽组的大肠杆菌数量显著降低(P＜0．05)，其中以200mg/kg抗菌肽组最低，显著低于150、250mg/kg抗菌肽组(P＜0．05)，但与喹乙醇组差异不显著(P＞0．05);喹乙醇组及200、250mg/kg抗菌肽组的总厌氧菌数量显著高于对照组(P＜0．05)，同时200、250mg/kg抗菌肽组还显著高于喹乙醇组(P＜0．05);喹乙醇组和各抗菌肽组的乳酸杆菌数量显著高于对照组(P＜0．05)，同时150、200mg/kg抗菌肽组还显著高于喹乙醇组(P＜0．05);150、200mg/kg抗菌肽组的双歧杆菌数量显著高于对照组和喹乙醇组(P＜0．05)，喹乙醇组则显著低于对照组(P＜0．05)，而250mg/kg抗菌肽组与对照组差异不显著(P＞0．05)。
2．3抗菌肽对肉兔血清免疫指标的影响由表4可知，喹乙醇和抗菌肽对血清IgG和C4含量无显著影响(P＞0．05);喹乙醇组及200、250mg/kg抗菌肽组的血清IgM含量显著高于对照组(P＜0．05)，同时200mg/kg抗菌肽组还显著高于150mg/kg抗菌肽组(P＜0．05);150、200mg/kg抗菌肽组的血清C3含量显著高于对照组(P＜0．05)，其他组之间差异不显著(P＞0．05)。
3讨论
3．1抗菌肽对肉兔小肠黏膜形态的影响小肠是家兔吸收营养物质的主要场所，其正常的结构是保证营养物质充分消化吸收的基础。小肠绒毛是小肠黏膜的主要结构，小肠绒毛高度、隐窝深度及绒毛高度与隐窝深度的比值是衡量小肠吸收功能的重要指标［16－17］。小肠绒毛高度的增加能增强小肠吸收营养物质的能力，同时小肠绒毛的有力摆动可以防止有害菌在肠道的定植，改善家兔的肠道健康［17］。小肠隐窝深度反映了细胞的生成率，隐窝变浅说明肠上皮细胞成熟率上升，细胞的分泌能力增强，消化液分泌增多可增强小肠的化学消化功能;同时还说明小肠黏膜上皮细胞的生长加快，对肠道损伤的修复作用增强。因此，小肠绒毛高度增加、隐窝深度变浅可增加小肠的吸收面积，提高小肠对饲料的利用率。绒毛高度与隐窝深度的比值则是综合反映小肠吸收能力的重要指标，当绒毛高度与隐窝深度的比值增高时，小肠绒毛对营养物质的吸收能力增强，反之则亦然［18］。马卫明等［12］研究发现，给肉鸡注射抗菌肽后，鸡十二指肠和回肠肠绒毛排列更加规则紧密，绒毛分支也明显增多，其肠绒毛呈粗圆指状，绒毛表面凹沟明显增多、变深。本试验结果发现，饲粮中添加不同水平的抗菌肽均不同程度地提高了十二指肠、空肠、回肠的绒毛高度，降低了小肠各段的隐窝深度，并提高了绒毛高度与隐窝深度的比值。这与王静［13］在肉鸡上的研究结果是一致的，说明抗菌肽可促进小肠绒毛的发育，保证小肠形态结构的完整性，增强小肠对营养物质的吸收功能。Bao等［19］和Liu等［20］也曾报道抗菌肽可以改善肉鸡小肠黏膜形态。
3．2抗菌肽对肉兔盲肠菌群的影响动物体内的正常菌群是重要的非特异性防御因素，它们的存在对于某些入侵的病原菌具有相当大的拮抗作用。正常菌群彼此保持着一种动态平衡，与宿主的正常生理功能有着密切的关系［21］。家兔盲肠在家兔营养物质利用过程中起着重要的作用，家兔盲肠的厌氧环境有利于厌氧菌的生长，同时盲肠微生物产生的挥发性脂肪酸也是家兔供能的一个重要过程。本试验结果表明，适量添加抗菌肽可以降低盲肠内总好氧菌、大肠杆菌的数量，增加乳酸杆菌、双歧杆菌及总厌氧菌的数量，这与陈晓生等［22］、余绍海［23］在肉鸭上得出的结果是一致的。关于抗菌肽的抗菌机制，普遍认为是通过作用于细菌的细胞膜，进而破坏膜的完整性，从而导致细菌死亡［24］。此外，有些人认为，通过破坏细胞膜抗菌并不是抗菌肽的唯一作用机制，一些抗菌肽通过作用于细胞内核酸达到抑菌效果，而非破坏膜的完整性［25］。黎观红等［1］报道，抗菌肽能够抑制大肠杆菌DNA、RNA和蛋白质的合成，从而起到抑制大肠杆菌增殖的作用;Peng等［26］在罗非鱼上的研究表明，抗菌肽可降低致病菌的黏附能力，有效地阻止致病菌在肠道上的定植，提高机体的抗病能力。本试验结果显示，添加适量的抗菌肽可增加乳酸杆菌等有益菌的数量，其可能原因是添加抗菌肽降低了肠道大肠杆菌的数量，从而减少了大肠杆菌对有益菌生长的竞争抑制作用，使有益菌大量增殖，肠道有益菌的增殖可以通过竞争抑制致病菌的生长，同时有益菌可产生乳酸、醋酸等，降低肠道pH，从而阻止致病菌的定植和繁殖，同时有益菌还可产生天然的抗生素来抑制和杀灭病原微生物，使大肠杆菌等病原菌进一步减少。本试验中添加250mg/kg抗菌肽时双歧杆菌和乳酸杆菌数量低于添加200mg/kg抗菌肽时，说明过量的抗菌肽可能对有益菌也有一定杀灭作用，具体作用机理有待进一步研究。
3．3抗菌肽对肉兔免疫功能的影响免疫球蛋白是动物体液免疫应答发挥免疫功能的主要免疫分子，在机体防御系统中发挥着重要功能，是反映机体免疫状况的重要指标。Yu-rong等［27］研究发现，从鸡肠道提取的抗菌肽可显著提高鸡血清IgG、IgM含量，增强鸡的体液免疫;Hanock等［28］也曾报道抗菌肽可提高机体内IgG含量;Bao等［19］、Liu等［20］、Wang等［29］的研究均表明，饲喂动物肠道来源的抗菌肽可以增强鸡的肠黏膜免疫。本试验结果表明，添加抗菌肽显著可增加肉兔血清IgM含量，且在添加量为200mg/kg时血清IgM含量最高，但对血清IgG含量则无显著影响，这与王静［18］和Yurong等［27］得出的抗菌肽可显著提高肉鸡血清IgG含量的报道不同，可能是由于所用受试动物及抗菌肽种类不同造成的。补体是动物机体抗感染的重要组成部分，参与机体的防御反应及免疫调节，是重要的生物效应系统和效应放大系统。C3在补体的激活过程中起着关键作用，C4在补体的活化阶段起着重要作用。本试验结果表明，抗菌肽可显著提高血清C3含量，对C4含量无显著影响。王静［13］也有抗菌肽显著提高肉鸡21和35日龄血清C3含量的报道。抗菌肽作为动物先天性免疫的防御分子，可直接参与先天性免疫，同时研究表明，抗菌肽还可发挥抗内毒素［30－31］及趋化因子［32－33］的作用，可诱导或激活信号分子和免疫细胞来提高机体的免疫系统。当病原菌入侵时，抗菌肽可直接发挥其杀菌功能，清除病原菌;也可发挥其趋化作用，使相应的免疫细胞聚集到感染部位，发挥其免疫作用。口服抗菌肽提高动物机体免疫功能的机理可能是通过优化肠道微生态环境和自身免疫物质的分泌来实现的，同时口服抗菌肽还可与肠道分泌的一些免疫物质协同作用，共同提高机体的免疫功能。抗菌肽还可能直接作为机体自身的一种免疫物质而被机体利用，直接参与机体的免疫反应，同时它们还可以通过趋化树突状细胞、单核细胞和记忆T细胞，在先天性免疫(非特异性免疫)和获得性免疫(特异性免疫)反应之间起桥梁作用，并启动获得性免疫系统，提高机体抵抗微生物感染的获得性免疫水平。
4结论
①在肉兔饲粮中添加抗菌肽可以改善小肠黏膜形态，刺激盲肠有益菌的增殖并抑制有害菌的增殖，同时还可提高机体的免疫功能。②本试验条件下，抗菌肽在肉兔饲粮中的适宜添加量为200mg/kg。
