本文作者：刘俊峰 刘亭亭 王 欢 王子龙 颜伟玉 曾志将 吴小波 单位：江西农业大学蜜蜂研究所

铜锌超氧化物歧化酶(copper/zincsuperoxidedismutase，Cu/Zn-SOD或SOD1)是超氧化物歧化酶(SOD)家族中最重要的一种金属抗氧化酶，广泛分布在真核细胞的细胞质、细胞核、过氧化酶体和线粒体膜间隙中;能转移性地清除超氧阴离子(O－2•)自由基，在维持氧自由基平衡方面起着重要的作用［1］。中华蜜蜂(Apisceranacerana)是东方蜜蜂(ApisceranaFabricius)的指名亚种，简称中蜂，是我国的一种特色经济昆虫，具有嗅觉灵敏、善于采集零星蜜粉源、对蜂螨的抵抗能力强、耐热抗寒的生命力及抗逆性等优点［2－3］。中华蜜蜂耐热抗寒的生命力及抗逆性是其优良性状的重要体现，这可能与蜜蜂机体抗氧化防御系统的准确调控密切相关，其中SOD1能及时与外界应激所产生的超氧阴离子自由基发生化学反应［4］，防止氧自由基破坏细胞的结构和功能，保护细胞免受氧化损伤。另外，动物营养学相关研究发现，不同营养水平的饲粮对动物机体的SOD活性影响很大，SOD可以作为评价机体营养状况的一个指标。而关于中华蜜蜂的各营养素的营养需要量研究才刚兴起。因此，对于中华蜜蜂SOD1(Acc-SOD1)蛋白质分子特性的了解及抗氧化机理的研究尤为重要。近些年来，国内外主要对西方蜜蜂的SOD进行研究，Weirich等［5］试验发现工蜂与蜂王的SOD在肌肉、蜜囊及血淋巴液中都有很高活性，且在交尾蜂王的肌肉中活性最大。Corona等［6］和肖培新等［7］研究报道意大利蜜蜂蜂王与工蜂不同发育时期及不同部位中SOD1基因的表达量有差异，蜂王头部表达量随着年龄的增长呈衰减的趋势;工蜂蛹期表达量较其他时期低。目前已对熊蜂(Bom-busignitus)［4］、野桑蚕(Bombyxmandarina)［8］、柞蚕(Antheraeapernyi)［9］及黑腹果蝇(Drosophilamel-anogaster)［10］等昆虫的SOD1基因做了较为深入的研究。然而，迄今没有对中华蜜蜂SOD1基因的相关报道，开展该基因的研究将有助于弄清其抗氧化机理，为以后利用该基因进行中华蜜蜂的抗逆性及营养需要量研究提供技术支撑。鉴于此，本研究根据意大利蜜蜂SOD1基因设计特异引物，克隆中华蜜蜂SOD1基因并进行序列分析，对不同发育时期，不同部位的基因表达量进行初步探索，为进一步研究中华蜜蜂营养需要以及抗氧化机理奠定基础。

1材料与方法

1．1试验材料供试昆虫:中华蜜蜂取自江西农业大学蜜蜂研究所蜂群。蜜蜂不同发育时期及部位样品采集:选用蜂群群势一致的中华蜜蜂5群。分别利用蜂王产卵控制器控制蜂王在一空巢脾中产卵6h，之后将蜂王移出。6d后，从巢脾中获取3日龄的幼虫。同理分别获取6日龄幼虫、1日龄蛹、4日龄蛹、1日龄成蜂以及7日龄成蜂，其中3日龄幼虫取60只，而其他时期均随机取6只个体，每20只3日龄幼虫或其他时期2只个体为1个重复，每时期3个重复;不同部位取样，分别取12只7日龄成蜂的头胸腹，每4个样品作为1个重复，共3个重复。样品采集后立即放入液氮速冻，转至－80℃保存，用于提取总RNA。主要试剂:总RNA提取试剂盒(Trizol)、pGEM-TEasy载体和RNA酶抑制剂均购自北京全式金公司;DNA分子质量标准(DNAmarkerDL2000)、M-MLV反转录酶及SYBRGreenⅡ定量试剂均购自日本TaKaRa公司;5－溴－4－氯－3－吲哚－β－D半乳糖苷(X-Gal)、异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)、dNTP、LA-TaqDNA聚合酶及凝胶回收试剂盒均购自美国PUEX公司。

1．2试验方法

1．2．1总RNA提取及cDNA第1链的合成Trizol法提取蜜蜂样品的总RNA，紫外分光光度计测定总RNA浓度和纯度。用反转录试剂盒对总RNA进行反转录，反应体系为50μL:8μL总RNA、10μL缓冲液、8μLdNTP、1．5μLM-MLV反转录酶、3μLOligodT、1μLRNA酶抑制剂、18．5μL焦碳酸二乙酯(DEPC)水。反转录反应条件如下:体系混匀后，42℃反应60min，75℃灭活5min。反转录产物保存于－20℃。

1．2．2中华蜜蜂SOD1基因引物设计、PCR扩增、克隆及测序引物设计:由于中华蜜蜂和意大利蜜蜂为2个亲缘关系最近的物种，同一基因的序列在这2物种间变异很小，因此，根据GenBank中意大利蜜蜂SOD1基因序列(GenBank登录号NM_001178027．1)，利用Oligo3．3软件，设计2对SOD1基因序列引物(SOD1-F1和SOD1-R1、SOD1-F2和SOD1-R2)，引物序列见表1。引物由上海生工生物工程技术有限公司合成。PCR扩增:在PCR扩增中，为了提高扩增的特异性，采用巢式PCR扩增。第1轮PCR扩增的反应体系(25μL):4μLcDNA、2．5μL10×PCR缓冲液、2μLdNTP、引物SOD1-F1和SOD1-R1各1μL、0．3μLLA-TaqDNA聚合酶，14．2μL双蒸水。扩增程序:94℃预变性4min;94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸1．5min，35个循环;72℃延伸10min;4℃保存待测。第2轮PCR扩增:将第1轮PCR扩增产物用双蒸水稀释1倍，取4μL作为模板，将引物换成SOD1-F2和SOD1-R2，反应体系的其他组成和扩增程序与第1轮扩增相同。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭(EB)染色后，蒸馏水漂洗，凝胶成像系统观察分析。克隆及测序:将PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳并割胶纯化，克隆于pGEM-TEasy载体内，最后将鉴定的阳性克隆菌送至上海生工进行测序。

1．2．3实时定量PCR分别以GenBank中华蜜蜂β－肌动蛋白(β-actin)基因(HM640276．1)及本试验中华蜜蜂SOD1基因的测序结果作为内参基因与目的基因，采用PrimerPremier5．0软件设计引物，设计出中华蜜蜂内参基因引物以及SOD1基因引物分别为Acc-β-actin-Q-F和Acc-β-actin-Q-R以及Acc-SOD1-Q-F和Acc-SOD1-Q-R，引物序列见表1。实时定量PCR反应体系(20μL):5μL反转录产物、目的基因上游和下游引物各0．4μL、4．2μL双蒸水、10μLSYBRGreenⅡ。PCR扩增程序为:94℃预变性3min;94℃30s，60℃30s，72℃40s，40个循环;72℃10min;最后以每5s上升0．5℃的速度从61～95℃记录熔解曲线，每个反转录样品重复3次。使用美国Bio-Rad公司iCycleriQ实时定量PCR检测系统。反应结束后收集目的基因与内参基因的阈值循环(CT)，数据分析方法参考Liu等［11］。

1．2．4数据分析采用SPSS17．0软件对原始数据Sqrt方法转换后，再进行one-wayANOVA方差分析，多重比较采用Duncan氏法，显著性水平为P＜0．05。

2结果与分析

2．1中华蜜蜂SOD1基因cDNA序列扩增及序列分析以中华蜜蜂总RNA反转录的cDNA为模板，利用引物SOD1-F1/SOD1-R1与SOD1-F2/SOD1-R2进行巢式PCR扩增获得1条631bp特异性片段(图1)，其目的基因cDNA克隆全长为631bp，编码152个氨基酸，在expasy网站(http://www．expasy．ch)预测蛋白质分子质量为15．65ku，等电点为6．21。利用预测的氨基酸序列在NCBI数据库中进行同源性分析显示该基因与其他物种的SOD1基因高度相似，表明所克隆的基因正是中华蜜蜂SOD1基因，命名为Acc-SOD1，在GenBank登录号为JN700517。该cDNA全长核苷酸序列如图2所示(推测的氨基酸序列位于核苷酸序列下方)。使用在线软件Scanprosite(http://www．expasy．org/tools/scanprosite)分析，该氨基酸序列中含有2个SOD1的特异序列［GFHVHEFGDNT(第42～52位)、GNAGARlACGVI(第136～147位)］。经NCBI网站中保守域数据库(conserveddomaindatabase，CDD，http://www．ncbi．nlm．nih．gov/cdd)分析(图3)，中华蜜蜂SOD1的氨基酸序列在第3～147位包含有铜锌超氧化物歧化酶超家族(cop-per/zincsuperoxidedismutasesuperfamily)的保守结构域。

2．2氨基酸序列相似性比较及进化树分析将中华蜜蜂SOD1基因所推导的氨基酸序列与已报道的其他昆虫SOD1基因在NCBI网站的在线程序bl2seq进行相似性比较(图4)。比较中分别选取意大利蜜蜂(GenBank登录号NP_001171498．1)、熊蜂(GenBank登录号AAZ79896．1)、家蚕(Bombyxmori，GenBank登录号NP_001037084．1)、野桑蚕(GenBank登录号CAL69462．1)、柞蚕(GenBank登录号ACN80149．1)、斜纹夜蛾(Spodopteraexigua，Gen-Bank登录号ABX11259．1)、冈比亚按蚊(Anophe-lesgambiae，GenBank登录号XP_311594．2)、黑腹果蝇(GenBank登录号CAA35210．1)、致倦库蚊(Culexquinquefasciatus，GenBank登录号XP_001866335．1)和埃及斑蚊(Aedesaegypti，GenBank登录号XP_001654772．1)。经Blast分析发现中华蜜蜂SOD1氨基酸序列与意大利蜜蜂的相似性高达99%，与熊蜂的相似性也有85%;与致倦库蚊、埃及斑蚊、冈比亚按蚊、斜纹夜蛾、家蚕、野桑蚕及果蝇等典型昆虫的相似性分别为75%、73%、71%、71%、70%、70%及67%。为了进一步研究中华蜜蜂与其他昆虫的SOD1蛋白的系统进化关系，采用Clustal_X1．8进行多序列比对并进行人工矫正［12］;采用MEGA4．0软件中邻位相连法(neighbor-joining)构建已知昆虫SOD1氨基酸序列的进化树(图5)，系统发生树进行了2000次重复构建［13］。从系统进化树发现中华蜜蜂与在同一进化分支上的意大利蜜蜂亲缘关系最近，熊蜂次之，与果蝇的进化关系有一定的距离。

2．3中华蜜蜂SOD1基因在不同发育时期、不同部位的表达量为研究中华蜜蜂SOD1基因在不同发育阶段的表达特性，以工蜂不同日龄幼虫、蛹和成虫为材料，采用实时定量PCR方法进行分析。由图6可见，中华蜜蜂SOD1基因在蜜蜂整个发育时期均有表达，且不同发育时期的表达量不同，中华蜜蜂SOD1基因的表达量在幼虫时期明显升高，在6日龄幼虫时期表达量达到峰值，而进入蛹期后逐渐降低，并在4日龄蛹期降至最低，在成蜂的2个日龄段，该基因的表达量趋于稳定。其中在幼虫时期，6日龄幼虫SOD1基因的表达量显著高于3日龄幼虫(P＜0．05);在蛹期，1日龄蛹显著高于4日龄蛹(P＜0．05)，而成蜂2时期的表达量没有差异(P＞0．05)。以7日龄成年工蜂的头、胸和腹为试验材料，进一步研究中华蜜蜂不同部位中SOD1基因的表达特性。由图7可见，该基因在成虫头、胸及腹中均有表达。中华蜜蜂SOD1基因在蜜蜂的头部与腹部的表达量均显著高于胸部(P＜0．05)，而头部与腹部之间没有差异(P＞0．05)。

3讨论

蜜蜂与其他昆虫一样，机体的抗氧化系统包括抗氧化酶类抗氧化剂及非酶类抗氧化剂2类。SOD是机体内唯一可清除超氧阴离子自由基的清除剂，能有效地防御过多活性氧自由基对生物体的毒害作用。SOD1在机体内广泛分布，是SOD家族中最重要的成员［13－15］。对中华蜜蜂SOD1功能研究还未见报道。本研究根据意大利蜜蜂SOD1基因设计引物，采用巢式PCR技术扩增并获得编码中华蜜蜂SOD1基因的cDNA片段。对预测的氨基酸序列进行分析，结果表明其编码蛋白质呈酸性，理论预测蛋白质分子质量为15．65ku。在中华蜜蜂SOD1氨基酸序列中包含的2个特异序列［GFHVHEFGDNT和GNAGAR-lACGVI］，与野桑蚕［8］和柞蚕［9］的特异序列结构一致，尤其是该基因氨基酸序列与同为膜翅目的意大利蜜蜂的相似性高达99%。SOD1基因在昆虫进化中高度保守，揭示了中华蜜蜂SOD1属于典型的铜锌超氧化物歧化酶超家族成员。系统聚类分析表明，中华蜜蜂与意大利蜜蜂亲缘关系最近，聚类分析与传统分类结果相似。从发育时期表达特性的结果(图6)中可以看出，SOD1基因在中华蜜蜂工蜂不同发育时期均有表达，且在整个发育阶段的表达趋势与意大利蜜蜂研究报道［5］基本一致。其中以4日龄蛹期的表达量最低，可能是昆虫在蛹期处于静止不运动的状态，其体内消耗的腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)应该较少［15］，机体中产生的活性氧自由基浓度相应降低，减缓机体内环境氧化应激速率，在氧化与抗氧化之间达到平衡［16］，相应地降低抗氧化酶中SOD1蛋白的水平。本试验结果中还发现中华蜜蜂工蜂发育时期的表达峰值出现在大幼虫期，可能是蜜蜂在大幼虫阶段采食量最大［17］，新陈代谢活动较强，机体上调抗氧化酶基因的表达，以清除体内过多的活性氧自由基，而与意大利蜜蜂SOD1基因的表达峰值出现在工蜂1日龄时期的结果不同［7］，在已报道的材料中，由于缺乏对意大利蜜蜂大幼虫时期SOD1基因表达特性的研究，也可能是因蜂种不同导致表达特异性不同，这有待于进一步研究与对比分析。另外，随着工蜂日龄的增长，蜜蜂会进行劳动分工，其劳动强度不一样，这是否会影响其基因的表达量也有待于进一步完善。部位特异性表达分析表明，中华蜜蜂工蜂的头、胸、腹部中均有SOD1基因的表达，这与意大利蜜蜂［6］的报道类似;中华蜜蜂工蜂头部及腹部SOD1基因的表达量远高于胸部，这可能是由于样品采自于7日龄工蜂的头胸腹，6～12日龄工蜂头部的王浆腺发达，作为哺育蜂承担着分泌王浆饲喂蜂王与小幼虫的工作，不出外采集食物［2］，咽下腺分泌活动能力最强，王浆和蛋白质分泌量均达高峰［18］，也使腹部消化系统的负荷加大，抗氧化酶基因的表达量也随之升高，其具体原因有待于进一步研究与论证。

4结论

①成功克隆了中华蜜蜂SOD1基因，cDNA长度为631bp，编码152个氨基酸，预测蛋白质分子质量为15．65ku，等电点为6．21。系统发生树显示，中华蜜蜂与其他昆虫亲缘性越近的物种，SOD1间的同源性也越高。②中华蜜蜂SOD1基因在各发育阶段、各部位均有表达，但表达量不同，在6日龄幼虫时期表达量达到峰值，在4日龄蛹期降至最低。中华蜜蜂SOD1基因在中华蜜蜂的头部与腹部表达量均显著高于胸部，而头部与腹部之间没有差异。

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