眼内炎即化脓性葡萄膜炎，是葡萄膜与视网膜的急性化脓性炎症，感染源主要分为外因性和内因性。外因如眼球穿通伤、角膜溃疡穿孔、内眼手术等，内因性眼内炎相对少见，一般起源于体内其他部位的化脓性炎症经血液流入眼中，引起葡萄膜化脓性炎症。外伤性眼内炎的起病急剧，发展迅速，预后不良，是眼外伤的严重并发症之一。其发病机制目前还不明确。一般认为，细菌感染是引起外伤后眼内炎的重要原因，但是有研究发现，在实验性金黄色葡萄球菌眼内炎中，即使眼内已无细菌生长，眼内炎症仍然持续相当长时间［1］。这提示细菌释放的毒素不是损伤眼部组织的唯一因素，机体本身的免疫应激反应也参与了眼内炎的发展过程。本研究在建立兔外伤性眼内炎模型后，在不同时间点抽取动物房水，通过检测房水中4种细胞因子的含量，观察这些细胞因子在眼内炎发病过程中的表达变化，分析外伤后机体自身的免疫反应，探讨眼内炎的免疫学发病机制，从而为治疗提供帮助。
1材料与方法
1．1实验动物与分组
健康日本大耳白兔18只，体质量2．0～2．5kg。将18只兔随机分为3组:Ⅰ组为正常对照组，Ⅱ组为无菌外伤组，Ⅲ组为葡萄球菌外伤组，每组6只兔。实验动物的使用严格遵循国家科学技术委员会发布的《实验动物管理条例》。
1．2外伤动物模型的建立
全身麻醉后手术显微镜下操作，Ⅱ组和Ⅲ组兔用无菌针头于右眼颞上角膜缘后3．5mm巩膜平坦部刺入眼球内部约4．0mm，并沿该穿刺口平行于角膜缘用剪刀延长球壁切口至7．0mm，深4．0mm。Ⅲ组兔眼玻璃体内再注入ATCC25923标准金黄色葡萄球菌105CFU•mL－1混悬液0．1mL，缝合创口后，无菌敷料包扎伤眼。
1．3细胞因子检测
1．3．1标本采集
盐酸奥布卡因表面麻醉兔右眼后，以1mL注射器角膜缘进行前房穿刺，分别抽取3组造模前及造模后6h、12h、24h、48h、96h房水0.1mL，－20℃保存，待测。
1．3．2细胞因子检测
标本取出后室温下解冻，取上清。ELISA法检测抽出房水标本中干扰素-γ(in-terferon-γ，IFN-γ)、白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、白细胞介素-8(interleukin-8，IL-8)、转化生长因子-β(TGF-β)的含量。
1．4炎症评分
造模后6h、12h、24h、48h、96h、8d、16d在裂隙灯及间接显微镜下观察受伤眼的结膜、角膜、虹膜、前房以及玻璃体的炎症情况，并根据Peyman等［2］的方法进行评分。
1．5病理切片
造模后16d处死实验动物，摘取3组动物受伤眼球，玻璃体内注射0．1mL固定液，将眼球置于固定液内，48h后石蜡包埋、切片，HE染色，光镜下观察视网膜炎症情况。
1．6统计学分析
采用SPSS17．0统计软件包做统计学分析。所有数据均用珋x±s表示，各组间临床炎症评分及各组间细胞因子含量比较采用方差分析;两两比较采用LSD-t检验，P＜0．05为差异有统计学意义。
2结果
2．1临床炎症评分
Ⅰ组未见明显炎症反应，各时间点临床炎症评分均为0分。Ⅱ组于造模后24h出现轻度炎症反应，玻璃体轻度混浊;造模后96h出现较严重的炎症反应，角膜轻度水肿，球结膜混合性充血、水肿，前房出现淡黄色积脓，玻璃体出现黄色反光。随后炎症反应进一步加重，于造模后8d达到高峰。Ⅲ组于造模后12h开始出现炎症反应，24h炎症反应已经较重，造模后8d炎症反应达到高峰。在造模后12h、24h、48h、96h、8d、16dⅢ组较Ⅱ组炎症反应更重，差异均有统计学意义(均为P＜0．05)，不同时间点两组临床炎症评分见表1。
2．2细胞因子含量的检测
不同时间点Ⅱ组和Ⅲ组房水中细胞因子的含量见表2。
2．2．1IFN-γ
Ⅱ组和Ⅲ组IFN-γ均于造模后6h开始升高，但与造模前相比差异均无统计学意义(均为P＞0．05);12h时升高明显，与造模前相比差异均有统计学意义(均为P＜0．05)，24h时达到高峰，48h时开始回落，96h时仍高于造模前(均为P＜0.05)。Ⅱ组和Ⅲ组各时间点相比差异均无统计学意义(均为P＞0．05)。
2．2．2IL-6
Ⅱ组和Ⅲ组IL-6均在炎症初期就迅速升高，造模后6h与造模前相比差异就有统计学意义(均为P＜0．05)，24h时达到高峰，48h时开始回落，96h时仍高于造模前(均为P＜0.05)。Ⅲ组和Ⅱ组各时间点相比差异均无统计学意义(均为P＞0．05)。
2．2．3IL-8
Ⅱ组和Ⅲ组IL-8均于造模后6h开始升高，12h时与造模前相比差异均有统计学意义(均为P＜0．05)，48h时达到高峰，96h时开始回落，但仍高于造模前(均为P＜0.05)。Ⅱ组和Ⅲ组各时间点相比差异均无统计学意义(均为P＞0．05)。
2．2．4TGF-β
Ⅱ组和Ⅲ组TGF-β均于造模后6h开始下降，12h时下降明显，与造模前相比差异有统计学意义(均为P＜0．05)，24h时降到最低。Ⅱ组和Ⅲ组各时间点相比差异均无统计学意义(均为P＞0．05)。
2．3病理检查结果
造模后16d病理检查结果显示，Ⅰ组仍为正常的视网膜结构，Ⅱ组视网膜可见少量炎症细胞浸润，Ⅲ组视网膜可见大量炎症细胞浸润(图1)。
3讨论
全世界大约160万的盲人是由于外伤所致，而外伤也造成了230万人双眼低视力，1900万人单眼盲或低视力［3］。据统计，临床上外伤后眼内炎发病率为3%～17%，而农村可达30%［4］。外伤后眼内炎发生的危险因素有:伤口污染、伤口较长、眼内有异物存留、晶状体囊膜破裂以及手术修补时间延迟等［5］。外伤性眼内炎的发病机制尚未完全明确。我们的实验中Ⅲ组的炎症反应较Ⅱ组更重，炎症评分造模12h后各时间点差异均有统计学意义，表明细菌感染是引起外伤后眼内炎加重的因素之一。外伤为细菌提供了一个进入眼内的通道，玻璃体的清除能力低下，并且玻璃体为细菌繁殖提供了一个良好的环境，细菌及产生的代谢产物扩散到周围组织，造成严重感染［6］。细菌感染以金黄色葡萄球菌最为常见，致盲率极高［7］。活金黄色葡萄球菌产生的外毒素，包括α-毒素、β-毒素等，是其主要的毒性致病因子［8-9］。这些毒性因子直接破坏眼部的组织结构，对眼球造成损伤，产生炎症反应。但是，我们在实验中发现，即使眼内没有细菌的存在，炎症反应仍在持续，明显的炎症出现在无菌生长时［1，10］，说明细菌分泌的毒性因子激活Toll样受体4(TLR4)，启动眼球局部免疫反应，TLR4通过髓样分化蛋白88下传信号，激活核因子2κB，促进表达共刺激因子，产生各种细胞因子，导致炎症过程的放大和持续。各种细胞因子在炎症反应中发挥各自的生物学活性，同时构成了错综复杂的网络，充当细胞、组织、内环境的信使，整合不同的功能单位，完成炎性反应［11］。
这些细胞因子的表达变化，破坏了机体的免疫平衡状态。本研究中，眼内炎发生后6h时IFN-γ开始升高，12h时升高明显，24h时达到高峰，48h时开始回落，96h时房水中的含量虽然已有大幅度减少，但是与造模前相比差异仍有统计学意义。IFN-γ的升高伴随眼内炎的整个过程，说明IFN-γ是促使眼内炎产生的一个非常重要的因子。IFN-γ参与了机体的迟发型超敏反应，玻璃体内注射IFN-γ，可直接引起眼内炎症的发生。IL-6在炎症初期就迅速升高，造模后6h时与造模前相比差异就有统计学意义，24h时达高峰，48h时开始回落，这可能是因为IL-6可诱导C反应蛋白等炎症急性期蛋白的产生，促进淋巴细胞的分化，在炎症初期就迅速被激活，参与炎症反应。IL-8于造模后6h时开始升高，12h时升高明显，与造模前相比差异有统计学意义，48h时达到高峰，96h时开始回落。细胞因子IL-8是嗜中性粒细胞的重要趋化因子，大约一半的眼内炎患者眼内液体中有IL-8的升高。IL-8也在炎症反应的初期就升高，使中性粒细胞迅速浸润炎症部位，造成炎症反应的加重。TGF-β于造模后6h开始下降，12h时下降明显，与造模前相比，差异有统计学意义(P＜0．05)，24h时降到最低。张开颜等［12］的实验也证明，房水TGF-β在实验性眼内炎造模5d后较造模前明显降低。TGF-β是控制眼内迟发型超敏反应的主要细胞因子，房水的主要免疫抑制活性来自TGF-β，可抑制淋巴细胞的增殖，对于稳定眼部的内环境起到至关重要的作用，TGF-β可以改变抗原呈递细胞的呈递过程，诱导前房相关免疫偏离的产生，其中TGF-β2发挥主要作用。正常房水中含有一定浓度的TGF-β，但是大多数TGF-β处于潜活状态，如何被激活目前还不清楚。实验证明，在细菌性眼内炎的眼中，TGF-β呈低表达状态，这说明眼内炎症的扩大与TGF-β的低分化有关。单纯的角膜穿通伤也会引起机体的应激反应，导致炎症因子的表达变化，Ⅱ组中仅有穿通伤的实验动物也有不同程度的炎症反应，这可能是由于房水中细胞因子的变化，造成了炎症细胞的浸润和血-视网膜屏障的破坏，导致了继发性炎症反应。
由于细胞因子在眼内炎的发生发展过程中起到非常重要的作用，因此可以采取干预细胞因子的网络来达到控制炎症反应的目的。目前很多研究围绕细胞因子网络的某些成员设计治疗方案，根据本研究结果，在眼内炎发生的初期抑制IFN-γ、IL-6、IL-8的产生，或者眼内注入活化的TGF-β都可以控制炎症反应。但是各种细胞因子对于该网络的稳定起着重要作用，打破这种稳定性可能会导致更严重的后果。因此，在眼内炎发生的早期，应用抗生素联合免疫抑制剂药物治疗才能有效地控制炎症，达到良好的治疗效果。
外伤性眼内炎的治疗仍然是困扰人们的一个难题。目前临床研究认为，玻璃体内注射敏感抗生素联合玻璃体切割手术是治疗眼内炎最有效的方法［13］。但是单纯的抗生素治疗仅仅能够控制细菌对眼的破坏作用，对于机体的免疫损伤并无明显的治疗意义，因此了解眼内炎的免疫学发病机制，对于眼内炎的预后至关重要。眼内过度的炎症反应可能是由细菌本身的毒性作用、多种细胞因子的表达变化和炎症细胞的过度分泌共同引起的［14］。细胞因子在炎症反应中具体怎样发挥作用，还有待于进一步的研究。本研究证明了细胞因子的表达变化在炎症早期起着重要的作用，炎症的加重与IFN-γ、IL-6、IL-8的高表达及TGF-β的低表达有关。因此，我们认为在眼内炎的早期，抑制细菌的同时，可以通过抑制免疫反应，阻断炎症的发展过程，从而起到减轻炎症反应、控制炎症的作用，对于眼内炎患者的预后有重要意义。
本文主要对无菌外伤及细菌性外伤导致的眼内炎进行了对比观察，并对炎症过程中细胞因子的表达情况进行了检测，为外伤性眼内炎的发病机制以及治疗措施的研究提供参考。当然，通过干预细胞因子网络来治疗眼内炎的方法尚不成熟，还需要更多细胞因子检测的进一步佐证和临床实践中的检验。
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