本文作者：杨洋 阚清 邱洁 浦晓丹 张盼 张晓群 周晓玉 单位：南京医科大学附属南京儿童医院新生儿科 南京医科大学儿科研究所

作为一类新近发现的调控分子，microRNAs(miRNAs)在细胞增殖、分化及凋亡等众多生理过程中都扮演着重要角色［1-3］。而至于它们的作用机制现也已得到基本认同，即miRNA可以同其特定的靶向mRNA结合，形成紧密的互补结构，最终导致mRNA的降解及翻译、表达受阻［4］。近年来有研究显示这些小RNA调控分子可以调节组织器官的发育［5］，却很少有研究涉及胎肺发育时miRNA的表达情况，即使有少数报道，其热点也主要局限于为数不多的几个miRNAs，如Let-7家族、miRNA-17-92簇等。如今随着芯片技术的发展及对肺发育机制理解的加深，更多有意义的miRNA尚待发现和研究，如miRNA-126/miRNA-126*，有研究发现在由小鼠胚胎干细胞演化而来的上皮细胞内miRNA-126和miRNA-126*均有高表达表现［6］。因此，我们推断miRNA-126/miRNA-126*在胚胎肺发育过程中也有同样的高表达表现，且可能是通过促进内皮细胞功能来发挥作用的。在本实验中，我们首先采用最新的miRCURYTM核酸锁芯片(v．16．0)(包含有超过1891个探针)，以期在胎肺发育后期探明miRNA-126/miRNA-126*的具体表达方式，后挑选出我们感兴趣的miRNA进一步研究以尝试阐明其可能涉及的发育机制。

1材料与方法

1．1实验动物健康成年Sprague-Dawley大鼠24只，购自南京医科大学动物实验中心，其中雌雄各12只，饲养在南京医科大学动物中心SPF环境中。将雌雄鼠胺1∶1合笼，次日雌鼠见阴栓计为孕1d。将12只孕鼠随机分为3组，分别是S1、S2、S3组，每组4只。3组分别在仔鼠胎龄为16d、19d和21d时应用水合氯醛处死妊娠母鼠，立即取出所有胎肺组织，并尽可能去除多余杂质组织。随后，应用PBS漂洗胎肺组织，每组保留一份胎肺用于形态学观察。剩余组织应用Trizol(Invitrogen公司)和miRNeasyminikit(Qiagen公司)抽提总RNA。RNA质量采用分光光度计(ND-1000，NanodropTech-nologies公司)进行检测。

1．2形态学观察3组胎肺组织均应用4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，行4μm连续切片。随后切片行苏木精－伊红(HE)染色，每个肺组织随机选取6张切片，每张切片随机选取6个视野置于光学显微镜下(×40倍)，观察3组间胎肺组织形态学结构变化。

1．3miRNA芯片各组胎肺组织进行RNA提取后，采用miRCU-RYTMHy3TM/Hy5TM标记(Exiqon，Vedbaek，Den-mark)以进行探针筛查。随后在杂交体系中(Nim-blegenSystems，Inc．，Madison，WI，USA)置于56°C下16～20h，进而促使激活反应，并且保持恒定的孵育温度以提升杂交的一致性和信号的灵敏度。最后在离心机上采用400rpm离心5min。随后将这些切片通过芯片扫描系统(AxonInstruments，FosterCity，CA)进行扫描观察。扫描图随后输入GenePixPro6．0软件进行数据分析。

1．4Real-timePCR各组胎肺中总RNA采用Trizol进行提取。单链cDNA的合成步骤如下:反转录混合物包含有1μg总RNA，1μMrno-miRNA反转录引物0．3μL(表1)，200U/μLMMLV逆转录酶0．1μL(Epicentre公司)，2μL10×RT缓冲液，2μLdNTP混合物，40U/μL核糖核酸酶抑制剂0．3μL(Epicentre公司)，补充ddH2O至20μL;反应条件为16℃下30min，42℃下40min，85℃下5min。在real-timePCR过程中，反应混合物包括1μLcDNA，2．5μL10×PCR缓冲液(Promega公司)，1单位Taq酶(Pro-mega公司)，终浓度为0．25×Sybergreen1(Invitro-gen)12．5μL及2μL引物(表2)，补充ddH2O至25μL;采用U6snRNA作为内参照，通过Rotor-Gene3000(CorbettResearch公司)real-timePCR系统进行反应，反应条件为95℃10min;95℃10s，60℃60s(收集荧光)，循环40次;扩增反应结束后，按95℃10s，60℃60s，95℃15s反应1次;最后从60℃缓慢加热到99℃。PCR的结果采用thresholdcycle(Ct)进行计算，而每个miRNA的相对表达量则采用2-(CTmicroRNA-CTU6)进行比较。

1．5统计学分析采用SPSS13．0统计软件对数据进行统计学分析，数据以均数±标准差(x±s)表示，多组间比较采用方差分析，P＜0．05为差异有统计学意义。

2结果

2．13组胎肺组织形态学观察在S1组中，肺上皮细胞开始分化成原始的气泡腔体样结构，间质部分非常致密(图1A);在S2组中，肺腺泡腔迅速扩大，间质组织较前变薄，并排列成条索状(图1B);在S3组中，更多成熟的肺泡出现，围绕在支气管周围，而间质比前两组更为稀疏(图1C)。

2．2miRNA芯片检测3组间miRNA-126/miR-NA-126*表达水平miRNA芯片检测结果显示miRNA-126在3组间相对表达较为稳定;而miRNA-126*在3组间则表现出了明显的表达差异，并依胎龄的增加其表达量呈逐渐上升。见图2。

2．3Real-timePCR检测3组间miRNA-126*表达水平Real-timePCR检测结果显示miRNA-126*表达水平在3组间随胎龄增加呈上升趋势(P＜0．05)，与芯片结果所示趋势相一致。见图3。

3讨论

大鼠胎肺发育包含5个阶段［7-8］，分别为胚芽期(胎龄第1～13天)，假腺管期(第13～18天)，小管期(第18～20天)，囊泡期(第20天～足月)及肺泡期(足月至生后5d)。其中第19天是Ⅱ型肺上皮细胞开始分化出现的时期，而Ⅱ型肺上皮细胞的产生又与表面活性物质的分泌等紧密相关，是胎肺发育的一个关键点。因而本实验挑选了胎龄19d前后共3个时间点(胎龄16d、胎龄19d、胎龄21d)，以期反映正常大鼠胚胎肺发育的后期阶段。在肺发育领域，既往研究较多的是一些有着重要地位的经典的miRNAs，如Let-7家族等。在本实验中，我们采用最新的芯片技术筛查了miRNA-126/miRNA-126*，这两者之前几乎从未在肺发育中被提及。miRNA-126/miRNA-126*来自于同一基因区带(均定位于Egfl7基因的9号内含子上)，首先被发现的是较为常见的miRNA-126(即miRNA-126-3p)［9］，随后人们探明了另一类miRNA-126，其是由具有同一前体形式miRNA的5'端处理而来，因此被命名为miRNA-126*(即miRNA-126-5p)。由于二者均由同一初级miRNA转化而来，同时研究发现在小鼠胚胎干细胞演化而来的上皮细胞内miRNA-126和miRNA-126*也均有高表达［6］。因此，它们在调控胚胎血管生成及维持血管完整性方面可能起着重要作用［6，10］。但是既往研究中二者的相关性主要局限于癌症发病机制中。其中由于miRNA-126可以作用于癌症组织中血管内皮生长因子(VEGFA)，Spred-1以及磷酸肌醇-3-激酶(PI3K)，其表达水平在人类乳腺癌中呈下降趋势。与之相对的是，在体外肺癌组织中，miRNA-126则表现出上调，并可减缓某些肺癌细胞系细胞的生长速率［11］。另外，Liu等［12］则集中研究了由LV-mir-126转染的肺癌细胞系及其他3种细胞系，结果发现miRNA-126可以有效地减少VEGF的表达，并且可作为潜在的肿瘤抑制剂阻滞细胞增殖。与此同时，其他两位研究者则证明了miRNA-126作为肿瘤抑制剂主要是基于其对禽类肉瘤病毒-10调控激酶(Crk)的调控，而Crk在肺癌中往往被认为同肿瘤侵蚀性有关［13-14］。以上这些均提示了miRNA-126/miRNA-126*不仅在胚胎发育血管生成方面，而且在癌症方面也有重要的作用。Musiyenko等［15］曾报道Egfl7的天然缺陷可致其内含子miRNA(miRNA-126*)的缺失，致使前列腺素高表达，进而间接促进了LNCaP前列腺癌细胞的侵蚀性。这是有关miRNA-126*为数不多的报道之一。已知内含子占有真核生物基因组的绝大多数部分，并且既往一直被认为是没有功能的［16-17］，但随着近来内含子miRNA的发现，研究者渐渐意识到原先被剔除的“无功能”内含子可能确有一定的作用，正如编码miRNA-126/miRNA-126*的Egfl7基因中9号内含子一样，现已不止一次被证明其在血管相关的组织细胞增殖中呈高水平表达，且在包括肺脏在内的特定器官里含量十分丰富［18-20］。另外，即使在几年前，人们尚认为在miRNA发生机制中，RNA的一条链优先与沉默复合体(RNA-inducedsilencingcomplex，RISC)结合，而另一条链(miRNA*)常被认为无功能而被降解［21］。但是近些年来，随着大规模RNA测序研究增多，miRNA*的发现也越来越多。就miRNA-126和miRNA-126*而言，两者都曾被测得在同一组织中有高表达，并发挥着同样重要的作用［22］。实际上，miRNA的两条链存在高度的组织特异性，且两条链均能各自有效地抑制其自身靶基因［23-24］。所以同miRNA-126相比，miRNA-126*在某些方面可能也有其自身的特定功能［25］。除此之外，由于miRNA-126/miRNA-126*均来源于Egfl7基因，且共有一条mRNA，故在之前报道中，两者的表达水平似乎一直是呈平行相关的［13，26］。然而，现今有少数研究报道miRNA-126的表达调控部分是独立于EGFL7蛋白之外的［27］，因而表明可能存在独立的启动子分别调控miRNA-126和miRNA-126*，这也进一步说明两者可能拥有不同的信号通路和生理机制，并发挥着各自不同的作用。在本实验中，经过芯片筛查，我们发现在3组间miRNA-126并没有表现出如同miRNA-126*一样的差异表达及上调趋势，而是在3个时间点间呈现稳定表达，这进一步证实了上述的猜测。而且随后re-al-timePCR的结果也表明miRNA-126*的表达在3组间差异均具有统计学意义。事实上，这是第一次在胎肺发育中报道miRNA-126*随着肺发育过程存在差异表达及上调趋势。根据这些结果，我们推测miRNA-126*可能在胎肺发育过程中扮演着重要的角色。既往对miRNA-126和miRNA-126*的研究主要局限于癌症领域，但是在胚胎期的细胞同癌症细胞在某些方面往往具有共性，如高度快速的分裂增殖能力等。miRNA-126/126*在癌症组织中的高表达水平已被证实同其在血管发生方面的作用密不可分，因此当在论及胚胎发育时，这两类miRNAs可能通过同样的机制来促进胎肺的发育成熟。当今临床上随着机械通气的广泛应用，发生呼吸窘迫综合征的早产儿、极低出生体重儿抢救成活率大大提高，但相关肺发育疾病的发生率也随之升高［28］。本实验的推论或许有助于阐明miRNA-126*在大鼠胎肺发育中所起的重要作用，并且对于以后进一步研究新生儿肺发育相关疾病(如支气管肺发育不良等)提供一定的理论基础。