本文作者：刘华联 徐天舒 江宏兵 邢树忠 单位：江苏常州市第一人民医院 南京医科大学口腔医学院

粘着斑激酶(focaladhesionkinase，FAK)是一种非受体酪氨酸激酶，通过多种信号通路在细胞周期调控、细胞骨架组装、黏附、迁徙、运动能力、生长调节、血管生成等多方面发挥了重要作用，是癌细胞产生失巢凋亡抗性、进而发生侵袭转移的关键性信号调控分子［1－3］。研究表明，FAK在口腔癌生长前沿区高表达，与颈淋巴结转移的关系密切［4］。本实验运用RNA干扰技术，通过对舌癌细胞Tca8113的体外实验，探讨FAK基因沉默对舌癌细胞侵袭和迁移能力的影响。

1材料与方法

1．1材料

1．1．1细胞和质粒舌癌细胞系Tca8113由南京医科大学口腔医学院惠赠，针对FAK的siRNA表达载体由上海吉凯基因有限公司合成并扩增。

1．1．2主要试剂新生牛血清(四季青公司，杭州)，RPMI1640培养基、G418(Gibco公司，美国)，Lipo-fectamineTM2000转染试剂(Invitrogen公司，美国)，羊抗人β-actin单克隆抗体、鼠抗人FAK抗体、HRP标IgG二抗(中杉金桥公司，北京)，蛋白显色试剂盒(Pierce公司，美国)，Transwell小室(Sigma公司，美国)。

1．2方法

1．2．1基因转染及克隆筛选于6孔板中每孔接种约3×105个Tca8113细胞，18～24h后细胞铺满约70%，将2μg质粒DNA和5μlLipofectamineTM2000转染试剂混合于100μl无血清无三抗的RPMI1640培养基中，室温孵育20min后逐滴加入每孔细胞培养液中，37℃、5%CO2条件下孵育5h后，换入新鲜含10%新生牛血清的RPMI1640培养基培养液。24h后，弃去原RPMI1640培养基，换用含有G418(400mg/L)的RPMI1640培养基选择性培养液，在标准环境下培养，2～3周后绝大多数细胞死亡，收集具有G418抗性的细胞克隆，扩大培养，命名为Tca-FAK。用同样方法将空质粒对照NON-siRNA转入Tca8113细胞中，命名为Tca-NON。

1．2．2Westernblot收获培养细胞，提取蛋白配制10%分离胶聚丙烯酰胺凝胶，每个加样孔中依次加入待测样品，SDS-PAGE(10%浓缩胶、8%分离胶)电泳12mA、2h，300mA、2h转膜，10%脱脂奶封闭;1∶200一抗4℃孵育24h，PBS洗10min，重复洗3次;加辣根过氧化物酶偶联的二抗，37℃下杂交1h，PBS洗10min，重复6次。按化学发光法显影、定影并检测膜上印迹。

1．2．3划痕试验将转染前后的细胞分别于6孔板中培养，细胞生长至完全汇合后使用200μl灭菌吸样枪头将细胞划痕，1×PBS洗1次，用含10%新生牛血清的RPMI1640培养基继续培养6h，使细胞恢复再换用含0．5%胎牛血清的RPMI1640培养基继续培养，在倒置显微镜下观察机械划伤后即刻(0h)各划痕部位并照相，48h后，再次在倒置显微镜下观察机械划痕并照相。于高倍镜下选取10个视野，用测微尺量取迁移起点距迁移最远端细胞核之间的距离。

1．2．4体外侵袭试验在Transwell小室内加入50μl200mg/L的Matrigel，风干备用。使用前RPMI1640培养液清洗，将配好的2×106个/ml3种细胞悬液分别加3孔，每孔100μl。将小室浸入24孔板的1640培养基中，37℃、5%CO2培养箱内孵育24h。取出小室，甲醇固定10min。用棉签小心擦去未侵袭的滤膜表面细胞，龙胆紫染色，中性树脂封片。在光学显微镜下随即选择5个视野，计算细胞总数，以侵袭细胞的相对数来表示肿瘤细胞的侵袭能力。

1．3统计学方法采用两均数的t检验分析实验组和对照组的数据。P＜0．05视为显著性差异。

2结果

2．1光共聚焦观察细胞形态将重组质粒转染Tca8113细胞，经G418筛选(约2周)后，挑取阳性克隆团扩大培养。激光共聚焦显微镜下观察，Tca-FAK中可见红色荧光蛋白的表达(图1A);Tca-NON组可见绿色荧光蛋白的表达(图1B)。另外，实验中发现，转染外源性质粒后细胞形态发生变化，细胞皱缩，细胞碎片增多。

2．2Western-blot测定Tca8113中FAK蛋白表达各组间β-actin的蛋白水平表达无明显差异，说明各组蛋白总的点样量基本一致。Tca-FAK组FAK蛋白条带较Tca-NON和未转染组蛋白条带明显减弱(图2)。

2．3FAK基因沉默前后细胞迁移能力的比较细胞划痕试验48h后，测量细胞迁移距离，正常Tca8113细胞的迁移距离为(0．91±0．03)mm，而FAK基因沉默后的Tca8113细胞的迁移能力明显降低，仅为(0．33±0．03)mm(图3～4)。

2．4FAK基因沉默前后细胞穿膜及侵袭能力的比较体外Transwell小室实验结果显示Tca8113细胞侵袭数目在FAK基因沉默前后发生明显变化，由原来的(213．3±4．5)个减少为(62．7±2．5)个(图5)。

3讨论

FAK在不同的组织中均有表达，但FAK在不同肿瘤组织中的表达是不同的，在前列腺癌、乳腺癌、结肠癌、卵巢癌、口腔癌和甲状腺癌的发生过程中，FAK的表达均有提高。FAK虽不具有经典的癌蛋白功能，但它在整合素信号转导和整合素所参与肿瘤发展过程及转移进程中都起着重要作用，这意味着FAK可能成为针对恶性细胞多元发展过程中的一个靶点。在口腔癌中，国内学者通过免疫组织化学的方法证实，FAK在口腔癌中高表达，与MMP2表达正相关，并且主要表达于口腔癌生长前沿区细胞及转移灶癌细胞，与颈淋巴结转移密切相关［4］。本实验中，我们通过体外试验也证实了FAK基因沉默可以抑制舌癌细胞株Tca8113的侵袭和迁移。进一步证实了FAK在口腔癌生物学行为中发挥重要作用。因此，深入探讨FAK在口腔癌侵袭及转移中的作用及其机制，有可能为口腔癌的治疗提供一条新的思路。正常实体组织细胞具有锚着依赖性生存(anchor-dependentsurvival)的特点，在脱黏附状态下会发生凋亡(细胞自身控制的程序化死亡)，即失巢凋亡(anoikis)。然而，转移的癌细胞则具有抗失巢凋亡的生存能力，这也是其发生远处转移的生物学机制之一。近年来，一系列体外试验研究发现，FAK不仅通过介导ECM细胞膜整合蛋白信号直接调控癌细胞的侵袭行为，而且可能通过对死亡受体Fas胞质结构域(又名Fas相关死亡结构域，fas-relateddeathdomain，FADD)的调节，参与癌细胞转移过程中失巢凋亡抗性的调控，FADD在凋亡信号传递中必不可少，当胞外凋亡信号经Fas传向胞内时，引起蛋白断裂酶系统的激活;另一方面，FAK通过过激活包括PI3K-Akt/PKB、MAPK在内的信号级联反应，补偿了由于失巢引起的源于细胞外基质的生存信号，使癌细胞获得了失巢生存的能力，进而发生转移［1，3，5－6］。在前期研究中，笔者构建靶向粘着斑激酶基因的小干涉RNA(smallinterferingRNA，siRNA)质粒表达载体，成功抑制人舌癌细胞Tca8113中FAK表达［7］。我们通过对舌癌细胞株Tca8113的体外实验发现FAK基因沉默可以逆转舌癌细胞株Tca8113体外培养过程中的抗失巢凋亡特性［8］。为了进一步探讨FAK在口腔癌生物学行为中的重要作用，本实验应用RNA干扰的方法沉默Tca8113细胞中的FAK，进而通过体外细胞划痕试验和Transwell小室侵袭试验观察FAK在口腔癌细胞侵袭和迁移中的作用。通过细胞体外实验研究发现，FAK基因沉默后，舌癌细胞株Tca8113的侵袭和迁移能力均明显降低。结合前期研究及国内外研究成果，我们认为FAK可能通过激活包括PI3K-Akt/PKB、MAPK在内的信号级联反应，补偿了由于失巢引起的源于细胞外基质的生存信号，使癌细胞获得了失巢生存的能力，进而发生转移，但其具体分子机制还有待进一步验证。

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