本文作者：李臻琰 邓征浩 李春涛 唐勇军 钟广伟 李炜 刘运生 刘景平 单位：中南大学湘雅医院 中西医结合研究所
脑挫裂伤是一种常见病，随着社会经济水平不断提高及交通工具的发展，脑挫裂伤的发病率持续升高。而小儿活泼好动，其独立和自身保护能力差，故脑挫裂伤的发病率较成年人上升快。因此深入探讨小儿脑挫裂伤的病理生理变化有利于其诊断、治疗和疗效评估，是当前研究热点之一。脑红蛋白(neuroglobin，Ngb)是继血红蛋白和肌红蛋白之后新发现的一种主要位于神经元内、能够可逆性结合氧的球蛋白。研究表明Ngb主要参与氧在中枢神经系统中的转运与贮存，在神经系统氧摄取、氧运输和氧利用等过程中起着极其重要的作用［1-2］，并作为一种内源性神经保护因子，在脑保护、改善神经功能和预后方面起着重要的作用。本课题组前期研究显示，脑外伤后脑组织中NgbmRNA的表达明显升高［3］，但有关Ngb在小儿脑挫裂伤病理生理过程中的变化尚不明确。本研究以脑挫裂伤患儿的脑组织及血清为样本，采用二维凝胶电泳和质谱技术分离、鉴定差异表达蛋白质，并运用免疫组化和酶联免疫法鉴定并观察了差异蛋白Ngb在脑挫裂伤患儿脑组织及血清中表达水平的动态变化，以阐明Ngb在小儿脑挫裂伤病理生理过程中的变化。
1资料与方法
1．1研究对象2011年8月～11月于中南大学湘雅医院就诊的脑挫裂伤患儿15例，其中男10例，女5例，年龄6～14岁，平均年龄9．0±1．8岁，受伤部位均为额叶。
1．1．1脑组织来源及分组15例脑挫裂伤患儿中，取8例重型颅脑外伤后患儿脑组织，其中男6例，女2例，年龄为6～14岁，平均年龄9．0±1．6岁，受伤部位均为右额叶。GCS评分为5～8分，血肿均由CT或MRI检查证实。另选取3例脑室肿瘤患儿为对照，在行肿瘤切除术过程中取得正常额叶皮层组织。部分标本在切除后立即置液氮中保存，供蛋白质检测;另一部分标本经4%多聚甲醛固定18h，常规脱水、石蜡包埋、4μm连续切片，供免疫组化检测。
1．1．2血清来源及分组采集所有患儿手术前、仅经一般治疗后的血清(选取病例的伤后时间相对固定)用于ELISA分析。正常人血清由年龄和性别匹配的10例志愿者提供。标本的获取均经患儿家长同意并签署知情同意书。
1．2试剂与仪器Ngb酶联免疫检测试剂盒(Sigma公司);大鼠抗Ngb多克隆抗体(美国SantaCruz公司);生物素二抗(美国SantaCruz公司);辣根过氧化物酶偶联的羊抗大鼠(美国SantaCruz公司);正常封闭血清、DAB显色试剂盒(北京中山生物技术有限公司);PVDF膜(Millipore公司);SP免疫组化试剂盒(迈新生物公司);磷酸、甘油、乙醇、EDTA二钠为国产分析纯。IPGphor等电聚焦仪、EttanDALTⅡ垂直电泳槽及ImageScanner扫描仪均为美国AmershamBio-sciences公司产品;MicroQ-TOF质谱仪为美国Wa-ters公司产品;石蜡自动包埋脱水机及石蜡自动连续切片机为德国Leica公司产品;混匀仪为美国Thermo公司产品;Multiskanspectrum型酶标仪为美国热电公司产品;AmershamEPS301型水平式电泳槽为美国PharmaciaBiotech公司产品;Alphamager2200型凝胶成像系统为美国AlphaInnotech公司产品。
1．3方法
1．3．1脑组织总蛋白的提取参照Araki等［4］的方法将处理过的标本取出，置于研磨管中，加入0．2mL组织裂解液在冰上将组织磨碎，4℃下12000r/min离心60min。取5μL上清液用于蛋白质浓度测定，剩余上清液冻存于－80℃备用。
1．3．2二维凝胶电泳操作步骤按照IPGphor等电聚焦系统使用指南进行。组织总蛋白提取物与水化液混合至总体积为450μL蛋白质样本，置于IPGphor等电聚焦仪上，按如下条件:30V水化14h后经500V1h、1000V1h、8000V10h进行等电聚焦。等电聚焦结束后，分别于10mL平衡A液和平衡B液中各平衡15min，转移至12．5%SDS-PAGE胶上端，在垂直电泳槽上进行第二向垂直电泳。电泳结束后，对2-DE胶进行考马斯亮蓝染色。实验重复3次。
1．3．3凝胶图像分析应用ImageScanner扫描仪扫描考马斯亮蓝染胶，并运用LabScan扫描软件获取图像，PDQuest2-DE软件比较分析对照组儿童和脑挫裂伤患儿脑组织蛋白二维电泳图谱的差异，选取表达水平相差2倍以上的蛋白质点进行质谱分析。
1．3．4质谱分析参照李美香等［5］的方法，将萃取后冻干的样品用萃取工作液约4μL溶解，用Tips反复在样品液中吸进压出循环操作，充分混匀后取0．6μL点于点样板上，再加0．6μLCCA基质工作液置空气中自然风干。肽段样品用MALDI-TOF-MS检测，质谱检测是在正离子反射模式中进行，N2激光源，波长337nm，飞行管长3m，加速电压20kV，反射电压23kV。质谱使用基质峰和胰酶自动降解离子峰作为内部标准校正。
1．3．5免疫组织化学染色采用SP法，按照北京中杉金桥生物技术有限公司提供的SP试剂盒说明书进行。然后进行切片、脱蜡及水化、漂洗及蒸馏水洗涤、微波修复、加入一、二抗孵育、光镜下观察、苏木素复染、树胶封片、光镜下观察切片染色情况并拍照。染色结果判定:Ngb蛋白的表达以细胞浆内出现明确的棕黄色颗粒为阳性细胞。采用双盲法，按以下标准进行半定量分析:每张切片至少观察5个高倍视野，不少于100个细胞，将各视野中阳性细胞的平均百分数作为该切片的阳性细胞百分比进行记分:0%～5%=0分，6%～25%=1分，26%～50%=2分，51%～75%=3分，＞75%=4分。染色强度以多数阳性细胞呈现的染色特征为标准记分:细胞未着色为0分，染色呈淡黄色为1分、棕黄色为2分、棕褐色为3分。最后以阳性细胞的百分比和染色强度记分之和进行结果判定，0～1分为阴性(－)，2～3分为弱阳性(+)，4～5分为中度阳性(2+)，6～7分为强阳性(3+)。用PBS溶液代替Ngb抗体作阴性对照，用已知阳性表达的脑外伤组织作阳性对照。
1．3．6血清样品的制备及Ngb浓度测定采集健康儿童和脑挫裂伤患儿空腹静脉血5mL，室温下凝固待血清析出，2000r/min，4℃离心15min，取上层血清，分装后－80℃冰箱保存。血清Ngb的检测严格参照试剂盒说明书进行，通过标准品浓度和其吸光度值绘制标准曲线，然后计算各样本的Ngb浓度。
1．4统计学分析应用SPSS15．0统计软件包进行统计学分析。各组数据采用均数±标准差(x±s)表示，组间比较采取独立样本t检验，P＜0．05为差异有统计学意义。
2结果
2．1脑组织双向凝胶电泳图谱在同等条件下对同一标本的总蛋白质样品分别进行了3次双向凝胶电泳，其总蛋白质的分布模式非常相似，以pI4～8和Mr20～75kD范围的蛋白质斑点分布最多。经过优化的2-DE条件获得了分辨率高、背景清晰的双向凝胶参考图谱。见图1。
2．2脑组织双向凝胶电泳图像分析PDQuest能够根据所选条件自动过滤背景，识别蛋白质斑点(图1)。在相同条件下对照组识别的蛋白质点个数为764±28个，脑挫裂伤组为753±19个。在图像分析时，选择利用软件自动匹配，并结合手工辅助匹配方法，即将对照组儿童脑组织的2-DE凝胶选为参考胶，手工设定一些明显相互匹配的蛋白质点作为参考斑点，即种子点，其他蛋白质斑点则自动依据种子点进行校正，从而完成整个匹配过程。对照组和脑挫裂伤组的平均匹配率分别为94%和91%。通过对两组比较分析匹配，筛选出两组差异表达的蛋白质点(在本次试验中认为相应检测点灰度值的百分比增高或降低2倍及以上者为有意义的差异点，即对照组与脑挫裂伤组点的灰度比大于等于2或小于等于0．5者为有意义的差异点)。与对照组相比，脑挫裂伤组中蛋白质表达上调的点有15个，下调的点有16个，选取其中6个被认为有意义的点进行质谱分析，6个差异蛋白质点在对照组及脑挫裂伤组脑组织中的表达量见表1。
2．3质谱鉴定结果选取上述具有显著差异的6个蛋白质点进行质谱分析和数据库查询，搜寻到5个有意义的蛋白质，它们分别为泛素羧基末端水解酶同工酶L1(ubiquit-incarboxyl-terminalhydrolaseisozymeL1，UCH-L1)、微管蛋白α链(tubulinalphachain-rat)、Ngb、二氢嘧啶酶相关蛋白2(dihydropyrimidinase-relatedprotein2)和硫氧还蛋白(thioredoxin，Trx)。见表2。
2．4免疫组化检测Ngb的表达变化免疫组化检测结果显示Ngb表达定位于胞浆内，胞浆内浅棕色物质即为Ngb检测阳性(图2)。在正常脑组织中Ngb呈弱阳性表达，脑挫裂伤脑组织则呈阳性表达;而挫裂伤灶周围水肿带脑组织的Ngb表达呈强阳性(表3)，与正常脑组织比较差异具有统计学意义(P＜0．05)。
2．5ELISA检测血清中Ngb的含量ELISA结果显示，在正常儿童血清中Ngb呈低表达;脑挫裂伤后3h血清中Ngb表达升高，在12h后Ngb达到峰值，其后表达逐渐下降，72h后Ngb表达恢复至正常(图3)。其中脑挫裂伤后6h、12h、18h、24h及48hNgb表达与对照组比较差异有统计学意义(P＜0．01)。
3讨论
小儿的解剖、生理、病理有自身特点，颅脑外伤发生后的临床表现异于成人，病情进展快，治疗棘手［6-7］。儿童重型颅脑损伤较为常见，对儿童重型颅脑损伤的救治是当今神经外科领域的重点及难点，虽然与成人相比，存活率较高，但致残率也高［8-9］。尽管儿童颅脑外伤的研究不断取得进展［10-11］，但对于颅脑外伤的诊断及预后判断缺乏好的评判方法。因此，深入探讨小儿脑挫裂伤的病理生理改变，以及加强对于儿童颅脑外伤的血清标志物的研究正成为目前医学工作的热点之一［12］。为了探讨小儿脑挫裂伤后脑组织中蛋白质的变化，本研究通过双向凝胶电泳技术建立了对照组儿童和脑挫裂伤组患儿分辨率高、重复性好的脑组织蛋白质表达图谱，找到了差异表达的蛋白质点，并运用PDquest图像分析软件识别了差异蛋白质点，再用MADLI-TOF和生物信息学技术对其中部分蛋白质点进行了鉴定和分析。结果显示5个有意义的蛋白质分别为泛素羧基末端水解酶同工酶L1、微管蛋白α链、Ngb、二氢嘧啶酶相关蛋白2和硫氧还蛋白。其中Ngb主要存在于人类和脊椎动物脑内，是一个新的内源性神经保护因子。生理条件下Ngb呈亚铁脱氧六配位形态，具有较强的氧亲和能力。缺氧能够诱导Ngb的表达，而高表达的Ngb则能够保护神经元免受缺氧损伤，从而在神经系统缺氧、缺血损伤中具有重要的神经保护功能。鉴于Ngb作为神经系统特异携氧分子的重要地位，目前有关Ngb基因克隆及其表达特征、空间结构、携氧动力学特征，以及所具有的神经保护功能等已被国际广泛关注。因此，Ngb与其他4个经质谱鉴定的蛋白质比较，更具有从实验及临床深入探讨的价值。故本研究选择Ngb作为重点研究对象。免疫组化结果表明，Ngb表达定位于胞浆内，胞浆内浅棕色物质即为Ngb检测阳性，这与众多学者的研究一致。在正常脑组织中Ngb呈弱阳性表达，脑挫裂伤脑组织中呈阳性表达;而挫裂伤灶周围水肿带脑组织中Ngb表达呈强阳性，与正常脑组织相比差异具有统计学意义。这很可能是神经元对脑挫裂伤应激的表现，在挫裂伤区域，由于神经细胞受到外力作用造成暴力损伤，从而导致原发性神经元死亡及多种原因造成的迟发性神经元死亡如细胞凋亡，使得损伤神经元Ngb的释放增加而部分健存神经元合成Ngb增加;而在挫裂伤灶周围水肿带脑组织(接近正常的脑组织)中，由于继发性脑缺血缺氧，导致Ngb在创伤早期就开始增加合成，从而促进氧向神经元内线粒体的扩散，以保持线粒体的正常功能并满足线粒体产能，从而在神经元的代偿保护中起到极其重要的作用，因此在这个时期可见Ngb表达明显增强。随着时间的推移，脑挫裂伤进入后期，脑组织的缺血缺氧及水肿逐渐减轻，Ngb的表达也逐渐恢复直至正常。Wang等［2］的研究发现，即使是在血氧体积分数较低的环境下，与氧具有较高亲和力的Ngb也能顺利地将氧跨越血脑脊液屏障向脑组织中转运，从而提高了脑组织氧的利用度［7］。本研究免疫组化结果显示，正常脑组织中Ngb呈弱阳性表达，而在脑挫裂伤灶及其周围接近正常的脑组织中分别呈阳性和强阳性表达，与林欣等［13］的动物实验结果一致。在血清中，正常儿童Ngb呈低表达;脑挫裂伤3h后Ngb表达升高，在12h后达到峰值，与吴巧灵［14］关于缺血缺氧性脑病所致脑损伤的研究结果类似。其可能原因是脑挫裂伤时部分脑血管扩张，血流量增加，血管压力增加，脑微血管内皮细胞胞饮作用增加;且脑挫裂伤可直接造成线粒体损害、Na+-K+-ATP酶失活，致使神经元处于氧化应激状态能量代谢障碍、膜稳定性破坏，进而诱导Ngb代偿性表达上调，以增加神经元的氧供、维持细胞膜稳定。然而，脑组织可产生大量一氧化氮和其他活性物质(如基质金属酶、缓激肽、花生四烯酸、血管生长因子等)，导致血脑屏障(BBB)通透性增加［15］，导致许多有害物质透过BBB到达大脑实质中，加重细胞毒性水肿，不仅引起血管源性脑水肿和继发脑出血，而且进一步破坏脑细胞微环境稳态，加重脑损伤，致使Ngb的表达随着伤情的加重而发生变化，致伤后12～72h逐渐下降，到72h表达恢复至正常。在正常情况下，Ngb在血清和脑脊液中的含量很低，但当脑缺血［16］、缺氧、中毒［17］或创伤时，细胞的完整性受到破坏，血脑屏障的通透性增加，脑红蛋白可泄露并出现在血清或脑脊液中，使其含量增加。王航雁等［18］及王静等［19］对新生儿和早产儿动脉血清中Ngb表达的观察也证明了这一点。因此，检测Ngb的血清学变化可在一定程度上反映出神经细胞的损伤和修复情况，反映研究对象的缺氧或缺血程度及神经细胞的受损程度。血清中Ngb的变化可作为脑损伤的一种潜在生物标记物，为临床评估和监测缺氧缺血脑病的严重程度提供参考。
