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医学论文范文:色素与唾液动力研究
色素与唾液动力研究
| 文章出自:论文下载 | 编辑:论文发表 | 点击: | 2013-04-12 20:59:23 |

在日常生活中,茶、红酒和食用色素是天然牙最易接触到的着色物。茶黄素(theaflavin,TF)、姜黄素(curcumin,Cur)和矢车菊素(cyanidin,Cy)是分别来自于茶叶、姜黄和葡萄的提取物,广泛应用于食品添加剂中[1]。作为色源体的天然色素与人全唾液(wholesaliva,WS)作用,可以沉积于牙面形成色渍,还可以与唾液蛋白结合,抑制蛋白质的活性,使口腔黏膜产生干燥和皱缩感[2]。表面等离子体共振(sur-faceplasmonresonance,SPR)技术可以将蛋白质分子自组装于SPR传感器芯片表面,特别适合于研究聚合物高分子与蛋白质之间的相互作用。本研究利用SPR技术,将WS自组装于芯片表面,考察色素TF、Cur和Cy吸附于WS表面的动态全过程,分析色素与WS蛋白质分子之间的相互作用和亲合力,探讨物体表面着色物形成和干燥及皱缩感产生的机制。

1材料和方法

1.1实验仪器及试剂SR7000DC型SPR仪(Reichert公司,美国)、Bio-fugeFresco型低温离心机(Heraeus公司,德国)、Mil-liporeDirect-Q3超纯水器(Millipore公司,法国)。高纯度的TF、Cur和Cy,二甲基亚砜(dimethylsulfoxide,DMSO)(日本西宝生物科技有限公司)。11-巯基十一烷酸(11-mercaptoundecanoicacid,11-MUA),1、3-二甲基氨基丙基-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐[1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimidehydrochlo-ride,EDC],N-羟基琥珀酰亚胺(N-hydroxysuccini-mide,NHS),牛血清白蛋白,缓冲液(phosphatebuf-fersolution,PBST);上述试剂均为美国Sigma公司产品。

1.2实验方法

1.2.1WS的收集和蛋白质量浓度的测定收集WS的具体步骤详见参考文献[3]。收集完成后采用Bradford法测定WS蛋白的质量浓度,测定步骤详见参考文献[4]。

1.2.2自组装WS膜SPR芯片置于60℃的10mmol•L-111-MUA/纯乙醇溶液中24h,取出后用纯乙醇冲洗,氮气吹干。通入1mL的体积比为1∶1的0.2mol•L-1EDC和0.1mol•L-1NHS的混合溶液,活化SPR芯片10min,然后注入1mL的WS溶液至吸附达到稳态,再注入1mol•L-1pH8.5的乙醇胺盐酸溶液1mL,维持10min,形成WS自组装单分子膜(self-assembledmonolayer,SAM)[5]。

1.2.3SPR动态监测在25℃条件下,将色素溶解于pH值为6.8的DMSO中,并以10mmol•L-1PBST稀释成不同浓度(0.02、0.03、0.04、0.05、0.06mmol•L-1)的溶液,以5μL•min-1的流速分别注入芯片,30min后色素吸附达到稳态。实时记录传感图谱。

1.2.4吸附动力学公式本研究选择两个吸附动力学公式,Langmuir公式[6]和Freundlich公式[7],二者分别为C/M=1/KLMm+C/Mm和logM=logKf+1/nlogC。式中C是被吸附溶液的浓度;M是吸附量;KL是Langmuir吸附常数,反映吸附过程的强度;Mm为饱和状态的最大吸附量;1/n是常数;Kf是Freundlich吸附常数,意义同KL。以C/M对C和logM对logC作图,求得直线的斜率和截距,进而求得吸附等温线常数:KL、Mm和Kf。SPR芯片上配体与分析物反应的速率公式[8]:dR/dt=kaCRmax-(kaC+k)dR。上式中C为分析物的浓度,Rmax为芯片上形成最多复合物时所得到的响应,R为在时间t时所得到的响应。以dR/dt对R作图可得到一条直线,其斜率为表观吸附常数Kobs,且Kobs=-(kaC+kd)。以-Kobs对C作图,同样可以得到一条直线,斜率即为结合速率常数ka,截距为解离速率常数kd。结合平衡常数KA=ka/kd,解离平衡常数KD=kd/ka[9]。

1.3统计学分析采用SPSS13.0统计软件进行统计学分析,对Langmuir和Freundlich吸附等温线的相关决定系数(R2)进行配对t检验;采用单因素方差分析比较不同色素对WS的吸附动力学常数总体均数之间的差异,SNK-q检验用于均数间的两两比较,检验水准为双侧α=0.05。

2结果

2.1WS蛋白的质量浓度采用Bradford法测定WS蛋白的质量浓度的平均值为1.043g•L-1。

2.2吸附模型R2的比较图1为在25℃、pH值为6.8、10mmol•L-1PBST的缓冲体系下,不同浓度的3种色素吸附于WS表面达到稳态后所记录的响应强度与时间的关系曲线。伴随着色素浓度的增大,响应值不断增大,提示吸附量不断增多。图2表示色素吸附于WS表面的Langmuir和Freundlich等温线和表观吸附常数Kobs与色素浓度的关系曲线。Langmuir模型下R2值为:TF为0.9200±0.0403、Cur为0.9268±0.0370、Cy为0.9803±0.0030;Freundlich模型下R2值为:TF为0.9831±0.0106、Cur为0.9947±0.0039、Cy为0.9977±0.0190。配对t检验结果为:两种模型下,TF、Cur和Cy的R2值之间的差异均具有统计学意义(P<0.05)。

2.3吸附动力学常数的比较根据图2及吸附动力学公式求得常数KL、Mm和Kf及其统计学结果见表1。方差分析结果表明:KL值之间的差异不具有统计学意义(P>0.05),提示采用Lang-muir模型采集的3种色素的吸附强度值相同;采用两种模型采集的Mm和Kf值之间的差异具有统计学意义(P<0.05),即TF>Cur>Cy。

2.4速率常数和平衡常数的比较速率常数和平衡常数的统计结果见表2:结合速率常数ka和结合平衡常数KA,其结果均为TF>Cur>Cy(P<0.05),解离速率常数kd和解离平衡常数KD则是Cy>Cur>TF(P<0.05),表明反应速率的变化趋势与Freundlich模型采集的吸附强度和亲和力趋势一致。

3讨论

3.1唾液SAMSAM是分子通过化学键相互作用自发吸附在固/液或气/液界面,形成热力学稳定、能量最低的有序膜。在本实验中,11-MUA末端的羧基在以EDC为催化剂的条件下与NHS反应,转换为N-羟基琥珀酰亚胺酯,从而与唾液蛋白分子中的氨基反应形成共价键结合,将蛋白质固定在固体表面。

3.2吸附模型本实验中色素对WS膜的Langmuir和Freundlich等温式的相关决定系数R2的配对t检验表明,Freundlich模型的R2值均大于Langmuir模型的R2值,且差异具有统计学意义,提示Freundlich模型更适合于描述本实验的吸附反应。同时Langmuir模型的3种色素的吸附常数值(KL)相同,而Freundlich模型的吸附常数值(K)f不相同,进一步表明吸附过程采用经验的Freundlich模型描述更为准确。

3.3亲和力由表1可知,Freundlich模型中反映相互作用的亲和力的动力学常数Kf值为TF>Cur>Cy,这表明茶黄素与唾液的亲和力最强,姜黄素次之,矢车菊素最小。速率常数和平衡常数的统计结果表明:茶黄素吸附于唾液表面的速度最快,且达到平衡状态的时间最短,姜黄素次之,矢车菊素最慢。色素吸附于唾液表面的亲和力的结果与吸附等温式的线性相关分析结果一致。在本研究中的3种酚式色素的分子结构中,茶黄素芳香环上有9个-OH,姜黄素有3个-OH和2个甲氧基,矢车菊素有5个-OH。理论上甲氧基比-OH具有更强的极性,能够在蛋白质分子与酚式色素间形成羰氢键连接,进而具有亲核加成能力[10]。由于姜黄素芳香环上的甲氧基的极性比矢车菊素分子结构中-OH的略大,因此,姜黄素的稳定性和生物活性强于矢车菊素,最终导致其在吸附反应中对唾液蛋白质的亲和力大于矢车菊素。当色素吸附于唾液蛋白质分子的表面时,由于存在质子转移,酚式色素上的-OH与唾液蛋白分子上的H+结合位点发生氢键结合[11]。综上所述,茶黄素芳香环上的-OH最多,故而生物活性最强,姜黄素次之,矢车菊素最弱。由此可见,酚式色素的生物活性随着其分子结构中羟基数量的增加而加强,这一结论与以往的研究结果相一致[12]。本实验通过对人唾液与色素之间的相互作用的动力学研究,建立了唾液和色素生物膜的体外分子模型,将色素吸附于唾液表面的研究深入到分子水平。动力学研究表明:唾液蛋白与色素之间的作用驱动力源自氢键反应。该模型的建立将有助于对牙着色机制进行深入研究,为预防牙着色的形成和改善牙的美观以及了解口腔黏膜表面产生干燥和皱缩感的生理学机制奠定实验依据。今后尚需在此动力学研究的基础上,考察不同的生理条件(温度、pH值和离子强度)下,色素对唾液蛋白构象和生化特性的影响。

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