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【摘要】　目的　探讨NAT2基因多态性与膀胱癌遗传易感性的关系。方法　以病例对照研究方法,采用PCR-RFLP技术,对69例膀胱癌患者和88例健康对照者的NAT2基因型进行检测,分析NAT2基因型的分布特征。结果　NAT2慢基因型在病例组的频率为26.1%(18/69),对照组为14.8%(13/88),差异有显著性(P<0.05),携带慢基因型者患膀胱癌的危险性比携带快基因型者高2倍。以NAT2快基因型/不吸烟者为参照,慢基因型/吸烟者患膀胱癌的危险性增加5.8倍(P<0.05)。在吸烟量>10PY(1PY=平均每年每天吸烟20支)的吸烟者中,病例组的慢基因型分布频率显著高于对照组(P<0.05)。病例组中, NAT2基因型与膀胱癌组织分级呈显著相关性(P<0.05)。慢基因型在表浅性肿瘤患者中的频率为12.8%,浸润性肿瘤患者则为54.5%,差异有显著性(P<0.01)。结论NAT2基因多态性与膀胱癌的易感性有关,携带慢基因型的人群易患膀胱癌,而且肿瘤恶性程度更高。

【主题词】　膀胱肿瘤;　NAT2基因;　遗传易感性;　基因多态性

膀胱癌是泌尿系统最常见的肿瘤,其发生与环境致癌物有关,例如吸烟是膀胱癌公认的重要病因。但并非全部吸烟者均发生膀胱癌,提示可能存在个体遗传易感性差异。研究表明,致癌物代谢酶基因多态是决定个体遗传易感性的重要基础,N-乙酰化转移酶(N-acetyltransferase, NAT)参与致癌物代谢,是体内重要的解毒机制。NAT基因定位于人染色体8p21.1-23.1,包含能编码有功能NAT蛋白的NAT1、NAT2基因和不编码有功能蛋白的NATP假性基因。其中,NAT2主要参与催化多环芳香胺类化合物的乙酰化过程。NAT2具有基因多态性,个体NAT2的多态性差异使其表型分为快代谢酶和慢代谢酶,导致芳香胺代谢速率的不同,从而与一些和芳香胺类密切相关的人类肿瘤的发生有关。Hein等[1]报道,NAT2快基因型与结肠癌有关,而NAT2慢基因型与膀胱癌有关。目前,国内有关NAT2基因多态与膀胱癌相关性的报道少见。为此,我们采用病例对照方法,对汉族人群膀胱癌患者进行NAT2基因多态性分析,以阐明其相互关系,为膀胱癌的防治提供理论依据。

材料与方法

1.研究对象:病例组69例,为2001年8月~2003年1月北京友谊医院泌尿外科住院手术的膀胱肿瘤患者。男56例,女13例,平均年龄58岁。吸烟者46例,不吸烟者23例。69例均为初诊膀胱癌患者,不包括膀胱癌复发患者。均未经化疗、放疗,并且无任何其他肿瘤病史。术后肿瘤组织经病理诊断均为膀胱移行细胞癌。WHO分级:G1 36例,G2 17例,G3 16例;TNM分期:浅表性(Ta~T1)47例,浸润性(T2~T4)22例。对照组88例,为同期我院健康查体者。病例组和对照组所选研究对象均为汉族人,在年龄和性别构成上均衡,结果具有可比性。

2.材料:调查对象均抽取静脉血5 ml,单结晶水枸橼酸、枸橼酸三钠、D-葡萄糖(ACD)抗凝。用美国Puregene公司DNA提取试剂盒提取基因组DNA。用Low Mass DNA Ladder进行DNA定量,稀释至20 ng/μl备用。

3.基因型检测:引物序列:5′-CCT CTC CTGCAGGTGACCAT-3′,5′-AGCATGAATCACTCTGCTTC-3′(815 bp)。PCR反应体系50μl,包括模板DNA0.5μg ,NAT2引物50 pmol,200μmol dNTPs,2.5 UTaq酶和相应的缓冲液。PCR反应程序:95℃预变性9 min;94℃1 min,57℃1 min,72℃1 min,35次循环。PCR扩增产物分别经限制性核酸内切酶KpnⅠ、TaqⅠ、BamHⅠ酶切。消化产物于4%琼脂糖凝胶电泳,紫外灯下观察结果。

4.检测结果判断: 4种NAT2等位基因的酶切位点见图1。NAT2基因主要在3个位点(481,590或857)发生突变,检测结果有4种等位基因:WT(野生型)、M1、M2和M3。等位基因M1表示KpnⅠ酶切位点缺失;等位基因M2表示TaqⅠ酶切位点缺失;等位基因M3表示BamHⅠ酶切位点缺失。NAT2快基因表型为含有WT的基因型(WT/WT、WT/M1、WT/M2、WT/M3),即纯合子或杂合子野生型;NAT2Wild Type:野生型等位基因;M1、M2、M3:突变型等位基因图1　4种NAT2等位基因的限制性酶切位点。NAT2基因PCR扩增产物长度为815 bp(322~1137),箭头代表限制性酶切位点(K=KpnⅠ,T=TaqⅠ,B=BamHⅠ)慢基因表型不包括WT基因型(M1/M1、M1/M2、M1/M3、M2/M2、M2/M3、M3/M3),即纯合子突变型。

5.统计学处理:以χ2检验确定基因型分布差异的显著性及基因型与肿瘤病理特征的关系,以比值比(OR)及95%可信区间(95%CI)表示相对危险度。

结果

1. NAT2基因型检测结果:157例标本中,共检测到4种NAT2等位基因:WT、M1、M2、M3(图2~4)。其中,病例组等位基因分布频率分别为:WT:55.6%;M1:2.8%;M2:25.7%;M3:15.9%。对照组等位基因分布频率分别为:WT:61.2%;M1:4.0%;M2:20.3%;M3:14.5%。病例组和对照组中,基因型分布频率与年龄无相关性(χ2=1.01,P>0.05 ;χ2=0.68,P>0.05),与性别也无相关性。

2. NAT2基因型与膀胱癌易感性的关系:病例组慢基因型的频率为26.1%(18/69),对照组则为14.8%(13/88),两者差异有显著性(χ2=4.61,P<0.05)。将慢基因型视为暴露因素,OR=2.0(95%CI=1.09~4.44),即携带慢基因型者患膀胱癌的危险性比携带快基因型者高2倍(表1)。

3. NAT2基因型和吸烟交互作用与膀胱癌危险性的关系:吸烟者中,NAT2慢基因型在病例组的分布频率为23.9%(11/46),在对照组为5.8%(3/51),两者差异有显著性(χ2=6.37,P<0.05)。以快基因型/不吸烟者为参照,快基因型/吸烟者(OR=1.15;95%CI=0.54~2.43)和慢基因型/不吸烟者(OR=1.11;95%CI=0.35~3.48)患膀胱癌的风险无明显增加(P>0.05);而慢基因型/吸烟者与之相比,OR=5.8(95%CI=1.42~23.92),即NAT2慢基因型者如果吸烟,患膀胱癌危险的将比快基因型/不吸烟者增加5.8倍(χ2=6.78,P<0.01)。吸烟量<10PY的吸烟者中,病例组和对照组的NAT2基因型分布频率差异无显著性(χ2=0.95,P>0.05);吸烟量>10PY的吸烟者中,病例组的慢基因型分布频率显著高于对照组(χ2=6.41,P<0.05;表2)。

表2　两组的NAT2基因型、吸烟量协同作用与膀胱癌易感性的关系组别<10PY快基因型慢基因型合计>10PY快基因型慢基因型合计病例组20 4 24 15 7 22对照组24 2 26 24 1 25OR(95%CI) 2.4(0.4~14.49) 11.2(1.25~100.31)4. NAT2基因型与膀胱癌临床病理特征的关系:NAT2基因型与膀胱癌组织分级呈显著相关性(χ2=7.62,P<0.05),G3肿瘤患者的慢基因型频率高于G1或G2患者(OR=6.22,95%CI=1.59~24.18)。慢基因型在表浅性肿瘤患者中的频率为12.8%,浸润性肿瘤患者则为54.5%,差异有显著性(χ2=13.57,P<0.01)。浸润性肿瘤(T2~T4)患者的慢基因型频率高于表浅性肿瘤(Ta~T1)患者(OR=8.20,95%CI=2.47~27.20)。