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采用IL-2和LAK细胞治疗恶性肿瘤以来,国内外对于IL-2和LAK细胞的抗癌机制和临床应用均进行了大量的研究,特别是近年来人基因重组IL-2的生产和应用,病人自身外周血制备LAK细胞和IL-2对于各种癌症的治疗均有报告[2],但在大多数中、晚期癌症病人中,由于病人自身衰竭和造血系统的损害,由病人自身获取大量的淋巴细胞培养LAK细胞的可能已非常困难。为解决这一问题,一些研究采用同种异体淋巴细胞和用胚胎胸腺与脾脏细胞培养LAK细胞并用于临床治疗,其结果均取得了不同程度的疗效[3]。人胚胸腺与脾LAK细胞用于病人治疗,是否激发受体自身免疫反应和输入胸腺细胞后的抗宿主免疫反应,这是人们非常关心的一个方面。为了澄清这一问题,作者对采用人胚胸腺和脾LAK细胞多次治疗并达2年以上的31例病人进行了追踪观察,现将结果报告如下。
资料与方法
一、临床资料 31例病人均为手术后的癌症病人,年龄36～64岁,其中男性23人,女性8人。肿瘤分类为,结肠癌11例、肝癌3例、乳腺癌6例、肺癌7例、肾癌2例、胰腺癌2例,所有病人均进行了肿瘤原发部的手术切除。
二、人胚胸腺、脾LAK细胞的培养与疗程 水囊引产胎儿,胎龄20～26周,消毒液浸泡消毒,无菌取胸腺与脾脏,去除包膜,制备单个细胞,以完全培养液将细胞配制成5×106ml,按每毫升3000U加入人基因重组白细胞介素2,37℃,5%CO2培养3～10天后使用。每个病人至少间隔治疗两个疗程以上,间隔时间5～8个月,其中2个疗程13人、3个疗程10人、4个疗程5人、5个疗程3人。每个疗程15天,15天内每天静脉点滴IL-2 50万单位,从第6天到第10天的5天内加用人胚胸腺与脾LAK细胞,每次5×108～8×108/100ml,混合50万U的IL-2静脉点滴。
三、实验室与追踪观察 所有病人均进行了两年以上的追踪观察,实验指标包括血清抗核抗体、抗心磷脂抗体、类风湿因子(抗自身IgGFc片断抗体)、抗人胚胸腺LAK细胞膜抗体(IgG和IgM型)、抗人胚胸腺LAK细胞浆蛋白抗体(IgG、IgM型)和供体胸腺LAK细胞与受体外周血单个核细胞间的相互杀伤作用。
四、实验方法
1.血清抗核抗体、抗心磷脂抗体、类风湿因子按常规方法检测。
2.特异性抗人胚胸腺LAK细胞抗体检测,取相同胸腺制备的LAK细胞,洗涤后分别制成细胞膜和胞浆蛋白抗原包被酶免疫反应板后,加不同时间接受该细胞治疗病人的血清和正常对照血清,37℃反应作用2小时后分别加入HRP标记的羊抗人IgM和羊抗人IgG抗体,37℃作用1小时,洗涤,加底物显色20分钟,于Σ9600酶标仪测定OD值。
3.胸腺LAK细胞治疗受体外周血单个核细胞与人胚胸腺LAK细胞混合培养杀伤试验,采用MTT实验方法。结果按公式:(1-测定管A值/LAK细胞对照A值+PBMC对照A值)×100%计算杀伤效率。
4.TNFα检测采用ELISA法按试剂盒操作说明。
结 果
所有病例均在准备IL-2和人胚胸腺LAK细胞治疗前和每次治疗结束后一周,取静脉血分离血清和外周血单个核细胞进行实验观察,结果所观察的各类非特异性自身抗体治疗前后,没有明显变化,并且与治疗次数无关。
讨 论
癌症病人的免疫功能低下,这已为人们所共识[4],现代肿瘤治疗,人们除仍然非常注重直接对癌肿组织的清除和杀伤外,还十分注意采用生物调控剂对机体免疫功能的调节和辅助。自1988年Rosenberg采用IL-2和LAK细胞治疗恶性肿瘤以来,免疫生物调变治疗已逐步形成临床癌症治疗的一个重要方面,特别是大剂量LAK细胞治疗对于部分肿瘤生长的抑制具有明确的作用,然而大量抽取病人血分离淋巴细胞培养LAK细胞,对于肿瘤病人常常不能做到。为解决这一问题,异体LAK细胞和人胚胸腺与脾LAK细胞的应用已成为临床十分重视的问题。异体LAK细胞的应用是否能造成受体免疫功能紊乱和诱发自身免疫反应,作者就此进行了观察。
实验中作者先后观察了28例经人胚胸腺LAK细胞治疗的病人,结果在2年的追踪观察中,没有一例发生过自身免疫损害。血清非特异性自身抗体经LAK细胞治疗后没有明显的变化,抗核抗体、抗心磷脂抗体和类风湿因子在人胚胸腺LAK细胞治疗后没有变化,血清TNFα治疗前和经多次治疗后也没有发生变化,血清浓度多在5 pg/ml的正常水平以内。这说明机体没有发生异常的炎症反应。人胚胸腺LAK细胞治疗后,受体免疫细胞对供体细胞或异体LAK细胞对受体淋巴细胞是否产生杀伤作用,作者的实验结果证明,两类细胞彼此间没有可见的杀伤作用。这说明人胚胸腺LAK细胞对受体正常淋巴细胞没有明显的危害作用,而受体也没有产生针对人胚胸腺LAK细胞的杀伤细胞。
特异性检测发现,经人胚胸腺LAK细胞治疗后,受体血清产生了低浓度的抗胸腺LAK细胞膜抗体,并且在LAK细胞治疗后主要是IgG型抗体,但OD值只略高于正常对照。抗胸腺LAK细胞浆蛋白抗体与胞膜抗体相似,OD值与正常人接近。作者的观察说明,人胚胸腺LAK细胞能诱发机体轻度的抗体反应,但这一反应的强度并不随LAK细胞治疗次数的增加而增高,但它提示多次人胚胸腺LAK细胞治疗后,机体可能产生抗体依赖的胸腺LAK细胞破坏作用,这一状态可能与多次输血反应中白细胞破坏作用相似。
总之,作者的观察说明,人胚胸腺LAK细胞治疗没有明显的受体免疫扰乱作用,虽然机体可能产生少量抗LAK细胞膜和胞浆蛋白抗体,但并未见明显的机体异常免疫反应。作者的研究提示,人胚胸腺LAK细胞具有较好的治疗安全性。
