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【摘要】目的:研究高压氧(HBO)治疗对弥漫性脑损伤大鼠 组织病理学的影响.方法:采用Marmarou介绍的落体打击装 置制作弥漫性脑损伤大鼠模型,观察大鼠脑外伤后6 h,1 d,2 d,3 d,1 wk,2 wk,3 wk的病理学变化及0.2 MPa高压氧治疗 对其影响,用免疫组化的方法观察损伤脑区NF表达情况,用 干湿重法测量脑组织含水量.结果:大鼠脑外伤后顶叶皮层与 海马出现不同程度神经元变性坏死;脑组织含水量较正常组 高;视束处NF染色可见神经丝蛋白凝集成块,周围有空隙; 给予高压氧治疗后坏死神经元较未治疗组明显减少,脑组织 含水量明显降低(P<0.05).结论:大鼠脑外伤后出现广泛神 经元变性坏死,大面积水肿,弥漫性轴突断裂,而高压氧治疗 可明显减轻血管源性脑水肿,改善脑组织供氧,使变性坏死神 经元数目减少.

【关键词】高压氧;脑损伤;脑;病理学;大鼠

0　引言

颅脑损伤,特别是重型颅脑损伤患者往往遗留不 同程度的神经精神症状和智力障碍,给家庭及社会带 来巨大的负担,甚至造成危害.经临床验证,高压氧 (hyperbaric oxygen, HBO)治疗对颅脑损伤、脑缺血、 脑卒中的恢复有较好疗效.由于临床研究的复杂性及 难控制性,我们以大鼠为对象探讨高压氧对弥漫性脑 损伤的治疗作用.

1　材料和方法

1.1　动物分组　选用第四军医大学实验动物中心提 供的健康成年雄性Sprague-Dawley大鼠75只,体质 量350~380 g.随机分为正常对照组(5只)、损伤组 (35只,损伤后6 h, 1 d, 2 d, 3 d, 1 wk, 2 wk, 3 wk,每个时间点5只)与高压氧治疗组(35只,每个 时间点5只).所有动物实验均严格按照有关实验室 动物照料及使用规则进行.

1.2　动物模型制备　采用Marmarou等[1]介绍的动 物损伤方法制作弥漫性脑损伤(diffuse brain injury, DBI)模型.用质量为450 g的物体,从150 cm高度自 由落下打击大鼠头部致伤.打击前用速眠新合剂腹腔 麻醉,将大鼠置于厚海绵床上,用牙胶将一块直径 10 mm、厚3 mm的钢板固定在大鼠的颅骨穹隆部, 使大鼠头部在打击后沿外力作用向前运动并避免颅 脑局限性损伤. 684第四军医大学学报(J Fourth Mil Med Univ)2003;24(8)

1.3　高压氧治疗　大鼠致伤3 h后,使用DWC450- 1150型动物实验舱进行高压氧治疗.动物进舱前,舱底 置新鲜钠石灰,进舱后,先以纯氧连续洗舱8 min,使氧 浓度达900 mL·L-1以上,再以0.013 MPa·min-1的加 压速率,用15 min加压至0.2 MPa,在高压下停留60 min,其间用纯氧通风10 min.停留毕,20 min减至常 压,每次共113 min,每日1~2次(第1周内2次·d-1, 之后1次·d-1),每周休息1 d.损伤组动物亦置于舱 内,模拟除压力、氧浓度外的类同实验组的其他过程和 环境条件.实验过程中,通过观察窗仔细观察动物在舱 内的行为状态.舱内温度18~24℃.

1.4　各组动物处理　采用Marmarou[1]等介绍的动 物损伤方法制作弥漫性脑损伤模型.治疗组大鼠给 予高压氧治疗,在动物致伤6 h,1 d,2 d,3 d,1 wk,2 wk,3 wk时,将大鼠用20 g·L-1戊巴比妥钠(60 mg· kg-1)腹腔麻醉,开胸暴露心脏,插管,由左心室经主 动脉快速灌注生理盐水200 mL, 40 mL·L-1多聚甲 醛-0.1 mol·L-1PBS液400 mL,断头取脑,再置于 多聚甲醛中浸泡6 h,根据大鼠脑定位图谱选取冠状 切面(Bregma-4.16 mm)皮层、海马、下丘脑平面,按 常规制成厚约5μm石蜡切片,并行HE染色.石蜡切 片常规脱蜡至水后,对抗原进行修复(切片置于pH 6.0,0·01 mol·L-1柠檬酸-柠檬酸盐缓冲液于水浴锅 中95℃30 min行热修复),自然冷却,0·01 mol·L-1 KPBS洗涤,分别加入一抗NF(1 3000)6 h、二抗IgG (1 300)2 h、ABC(1 500)2 h(一抗、二抗及ABC均购 自武汉博士德公司,一抗用3 g·L-1Triton X-100处 理的小牛血清稀释,二抗、三抗用KPBS稀释),DAB 棕色显色,蒸馏水终止反应,水洗,常规脱水透明,中 性树脂封固,KPBS代替一抗作阴性对照.

1.5　脑组织含水量测定　大鼠断头后快速取金属垫 下顶部皮层脑组织一块,先称湿重,放入110℃烘箱 烘烤24 h后再测干重.按公式计算脑组织含水量: 脑组织含水量(%)=〔(湿重-干重)/湿重〕×100%

1.6　变性坏死神经元计数　神经元损伤主要表现为 神经元肿胀或皱缩,核仁消失,核膜溶解,胞质强烈嗜 伊红性和胞核固缩.核酸进一步溶解消失,苏木素着 色力丧失,表现为“鬼细胞”(gost cell)[2].在海马与齿 状回互包平面将脑组织的顶叶皮层、海马2个区,分 别观察5个高倍镜视野(×400)记数变性坏死神经元 数目.计算求得平均各区变性坏死神经元数目,以 number/field表示. 统计学处理:细胞记数采用SPSS10·0软件作方 差分析.

2　结果

2.1　动物行为　受打击的动物,伤后即刻出现呼吸 暂停数秒,16只动物出现持续数秒的轻度全身抽搐 (损伤组7只,治疗组9只),有的伴有去皮层综合征 (表现为双侧前肢屈曲,双侧后肢强直,颈项强直等). 经辅助呼吸后多数可恢复规则的自主呼吸.与正常对 照动物相比,麻醉恢复要迟十几分钟至半小时.各组 动物在致伤后2 h基本苏醒.治疗组在致伤后3 h开 始高压氧治疗,治疗过程中未见有动物抽搐发作.