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灵芝是我国著名的中药之一,可以增强体液和细胞免疫。1996年Hmi等[1]研究显示,灵芝实体水提物的低分子量部分对人类免疫缺陷病毒(human mi munodefiency virus, HIV)增生具有很强的抑制作用,其甲醇提取物的中性和碱性部分能抑制HIV-1 增殖。1998年, el-Mekkawy等[2]从灵芝中提取出具有抗HIV-1细胞免疫和抑制HIV-1蛋白酶的物质。 Lin等[3]研究认为,灵芝中的免疫调节物质可能是通过细胞核因子-κB (nuclear factorkappaB, NF-κB)和丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein ki- nase, MAPK)途径,激活和促进人的单核源性树突状细胞成熟,提高细胞免疫功能,抵抗HIV-1感染。本研究采用恒河猴制造的猴获得性免疫缺陷综合征 (smi ian acquired mi mune deficiency syndrome, SAIDS) 模型,初步观察了中药灵芝制剂治疗SAIDS的疗效。
材料和方法
材料 成年雌性中国恒河猴5只,体重6·11~ 9·35 kg,购自北京协尔鑫生物资源研究所,许可证编号: SCXK (京) 2005-0005,生物安全环境下饲养。猴免疫缺陷病毒(smi ian mi munodeficiency virus, SIV) SIVmac239株由美国Aaron Diamond艾滋病研究中心PA·Marx教授惠赠。灵芝孢子油(300 mg/粒, 100%纯灵芝孢子油,美善堂),破壁灵芝孢子粉胶囊 [300mg/粒,破壁灵芝孢子(内含20%孢子油)+20% 灵芝子实体精华,美善堂]。
SAIDS模型的建立 所有动物实验前经检查体内无SIV、猴逆转录D型病毒( smi ian retrovirus, SRV)和猴T淋巴细胞趋向性病毒1型(smi ian T- lymphotropic virus type 1, STLV-1)抗体。采用恒河猴外周血单核细胞(peripheralbloodmononuclear cel,l PBMC)于体外扩增病毒液,病毒滴度为5× 105TCID50/ml。在氯胺酮麻醉下,将1·0ml病毒原液经肛门注入恒河猴直肠内进行感染,存活17个月后用于实验。
方法 参考免疫学和病毒学情况将5只AIDS猴分为两组: (1)治疗组(n=3):第1疗程:每日口服1次灵芝孢子油和破壁灵芝孢子粉胶囊各2粒, 每周服6d,周日停服,共8周;停药6周;第2疗程:方案完全同第1疗程;停药6周;第3疗程:服药方案同第1疗程,共4个月。(2)对照组(n= 2):不服用灵芝制剂。两组猴发生腹泻时,均给予对症治疗。
实验室检测 于治疗前和治疗后每4周左右采集猴静脉血进行血液学、免疫学和病毒学指标检测。
血液学检查:采用Beckman Coulter/AC·T 5 diff (美国贝克曼库尔特公司)进行血常规检测。
免疫学检查:采用FACS Canto流式细胞仪(美国BD公司)检测CD4+、CD8+T淋巴细胞计数。单抗为小鼠抗人CD3 APC (Cat·No·557597)、小鼠抗人CD4 FITC (Cat·No·550628)、小鼠抗人CD8 PE(Cat·No·555367) (美国BD公司)。
病毒学检查:采集EDTA抗凝全血,分离血浆冻存;以QIAGEN-QIAampViralRNAMini试剂盒提取病毒RNA,以ABI TaqMan探针法进行实时荧光 PCR检测病毒载量;上游引物为: 5 -GAGGAAAA- GAAATTTGGAGCAGAA-3 ;下游引物为: 5 -GCTTG- ATGGTCTCCCACACAA-3 。探针序列为: 6-Fam-AAG- GTTGCACCCCCTATGACATTAATCAGATGTTATAMRA。在ABI 7300 real-tmi e PCR仪器(美国ABI公司)上进行数据获取和分析。每个样品均提取和检测复孔。反应条件为: 48℃35 min; 95℃10 min; 95℃15 s, 60℃1 min, 45个周期。
病理学检查:实验期间行腋窝或腹股沟淋巴结活检,实验期间死亡的猴及实验结束时行安乐死的猴做病理尸检。常规制片HE染色,采用甲苯胺蓝染色法观察尼氏小体[4], Peacse氏染色法观察脑垂体[5],免疫组织化学染色检测凋亡细胞(ApopTagR PlusPeroxidase In SituApoptosisDetectionKit试剂盒购自美国Millipore公司), Ki67抗体(购自美国BD公司)、NK细胞(标记物CD56购自北京中杉金桥生物技术有限公司,目录号: ZM-0057,克隆号: 123c3)和滤泡树突状细胞(标记物CD35购自北京中杉金桥生物技术有限公司,目录号: ZM-0275,克隆号: RLB25)。病理切片神经细胞计算方法采用 Image-Pro Plus 4·5软件(美国Media Cybernetics公司)。
结 果
一般情况 治疗组3只猴(#374、#381、#393) 中, 2只(#374、#381)在1年的实验期中健康情况良好、体重稳定,其中1只(#374)实验前有间歇腹泻史,服药后减轻; 1只(#393)于实验3·5 个月死亡。对照组2只猴分别于实验6个月(#361) 和11个月(#348)死亡,均死于SAIDS后期,表现为体重下降、极度衰竭,尸检显示为淋巴组织耗竭和机会性真菌感染。
血液学检查结果 治疗组死亡猴#393死亡前红细胞明显下降,从治疗前的5·65×106/μl降至死亡前的 1·17×106/μ;l #381后期也有所下降,从治疗前的 4·78×106/μl降至治疗后52周的2·34×106/μ;l其余猴亦有些波动,但不太明显(图1)。治疗组猴#374 治疗后白细胞也有升高或略下降,但总体持平,其余猴均略为下降(图2)。
免疫学检查结果
CD4+T淋巴细胞:实验开始时,治疗组猴#374、 #381和#393的CD4+T淋巴细胞计数分别为285、 451和368/μl。实验期间, #374除11、40和47周外,其他各采样点均高于治疗前(292~550/μl); #381波动幅度较大(222~623/μl); #393在实验开始后3·5个月死亡。实验开始时,对照组猴#348和#361 的CD4+T淋巴细胞计数分别为1309和110/μ;l #348 于实验开始后11个月死亡,期间波动幅度较大(797~ 1910/μl),死亡时为553/μ;l #361于实验开始后6个月死亡,期间始终在低值波动(34~168/μl),死亡时为191/μl (图3)。
CD8+T淋巴细胞:实验开始时,治疗组3只猴 #374、#381和#393的CD8+T淋巴细胞计数分别为 411、780和729/μ;l实验期间, #374波动幅度较小 (238~579/μl), #381波动幅度较大(219~1105/μl), #393在实验开始后3·5个月死亡。实验开始时,对照组2只猴#348和#361的CD8+T淋巴细胞计数分别为1302和356/μ;l #348于实验开始后11个月死亡,期间波动幅度基本不大(574~1079/μl),死亡时降至最低点,为276/μ;l #361于实验开始后6个月死亡,期间波动不大(88~280/μl),死亡时为 277/μl (图3)。
病毒学检查结果 实验开始时,治疗组猴#374、 #381和#393的血浆病毒载量分别为2·34×107、 2·23×106和1·05×106copies/m;l实验期间, #374 和#381缓慢下降,至实验结束时分别为2·2×106和 8·6×104copies/m,l在3个疗程停药期间血浆病毒载量均无明显反跳现象。#393在实验开始后3·5个月死亡,死亡时为2·04×106copies/ml。实验开始时,对照组2只猴#348和#361的血浆病毒载量分别为1·34×106和1·22×106copies/m;l #348于实验开始后11个月死亡,实验期间病毒载量略有波动,死亡时为1·5×106copies /m;l #361于实验开始后6个月死亡,死亡时为7·0×106copies /m,l高于治疗前 (图4)。
淋巴免疫器官病理学检查结果淋巴结:治疗组3只猴中, #393于实验开始后 3·5个月死亡,尸检淋巴结呈耗竭状态。#374和#381 的淋巴结在实验开始前表现为生发中心轻度增生,第 2疗程生发中心出现少数淋巴细胞凋亡, 2个疗程后淋巴结滤泡、生发中心、副皮质和髓质逐步好转,向常态淋巴结结构发展,实验结束时淋巴结基本呈常态淋巴结组织模式(图5A);免疫组织化学染色结果显示,淋巴结生发中心细胞呈阳性(图5B),淋巴结的自然杀伤细胞(natural killer cel,l NK)和树突状细胞(dendritic cells)比正常猴明显增多(图5D~5F)。
对照组2只猴中, #348尸检可见脾萎缩,脾小体数量减少和高度萎缩,生发中心及套层消失,残存中央动脉周围有少量淋巴细胞浸润,红髓内只有少量髓窦细胞和淋巴细胞,髓区内出现多量纤维细胞和纤维化; #361尸检可见脾脏高度萎缩,脾小体萎缩, 生发中心和套层消失,中央动脉纤维化,其旁有不等量淋巴细胞浸润,红髓内有少量髓窦和淋巴细胞, 出现多量纤维细胞和纤维化(图6B)。
胸腺:治疗组猴#374和#381尸检时发现前纵膈上有胸腺组织,其中#374的胸腺大小为5cm×2cm, #393的胸腺消失。镜检可见#374胸腺呈岛屿式生长,胸腺皮质和髓质向邻周脂肪组织呈蚕食性生长 (图7A), Ki67免疫组织化学染色为阳性(图7B), 对照组猴的胸腺均消失。
中枢神经系统病理学检查结果
治疗组猴#374丘脑可见1个胶质细胞小结。桥脑、延脑、脊髓呈轻度脑白质病变;猴#381机遇性感染巨细胞病毒,出现脑膜炎和脑炎。对照组猴#361的丘脑、基底节和桥脑显示围管浸润,桥脑、延脑、脊髓侧索脑白质病。
HE染色和免疫组织化学Tunel染色结果显示, 治疗组猴#374丘脑室旁核神经细胞数量多于猴#361 (图8A、8C),对照组猴#361的凋亡阳性神经细胞多于猴#374 (图8B、8D)。治疗组猴#374的海马回及#381的海马回和扣打回可见新生神经细胞,细胞体积大、红染、胞核大居中,有些细胞长出神经触突(图9B), Ki67免疫组织化学染色呈阳性(图9C),尼氏小体染色也呈阳性(图9D)。对照组猴#361海马回未见此现象 (图9A)。两组猴的中枢神经细胞均出现了不同细胞胞质和胞核的病变。对照组猴#361延脑的舌下神经细胞核团出现神经细胞固缩,尼氏体消失,核膜破解, 染色质凝聚,胞核消失,核仁和核仁小体消失等现象(图10)。以神经细胞核的消失为标志进行计算,结果显示治疗组猴#374和对照组猴#361下丘脑、海马、桥脑、延脑、脊髓的无核神经细胞比率分别为18·46% 和26·45%、3·8%和9·06%、25·35%和48·5%、 13·25%和50·0%、29·63%和56·52%。内分泌系统病理学检查结果脑垂体:治疗组猴#374和#381前叶嗜酸性细胞胞质丰满(图11A);对照组猴#361大部分嗜酸性细胞胞质缺失,只见嗜酸性细胞胞体和胞核(图 11B)。
松果体:治疗组猴#381松果体腺泡增大,部分松果体细胞胞质逸出(图12A);对照组猴#361松果体细胞萎缩,胞质少,泡间纤维组织增加(图 12B)。甲状腺:治疗组猴#374和#381腺泡大小略有不等,胶体充盈腺泡,胶体着红色(图13A);对照组猴#361和#348腺泡大小不等,胶体不足或缺如,着色淡(图13B)。肾上腺:治疗组猴#374和#381肾上腺皮质3个带细胞的结构未见异常,带状细胞质含大量类脂质, 髓质的嗜铬细胞未见异常(图14A);对照组猴#361 和#348束状带细胞含蛋白性胞质,髓质萎缩(图 14B)。卵巢:治疗组猴#374和#381表现为常态,即原、初、次级卵泡数量不减,卵泡发育无异常,并且出现一个次级双核卵母细胞(图15A);对照组猴 #361原、初、次级卵泡减少,部分卵泡退行变性 (图15B)。其他系统病理学检查结果心脏:治疗组猴#374和对照组猴#361小灶性心肌炎。肺脏:治疗组猴#381、#393和对照组猴#361均可见间质性肺炎和肺真菌感染。胃、肠、肝:治疗组猴#374、#381和#393均可见轻度小肠炎,肝内存在灶性坏死灶;对照组猴#361可见小肠炎,肝灶性坏死灶, #348轻度肝硬化。肾:治疗组和对照组猴均可见轻度膜性肾炎和间质性肾炎。
讨 论
吴小闲等[6]报道采用SIVmac251建立慢性感染猴的模型,感染时间长达360 d,其临床表现、病毒学和免疫学的变化和病情进展类似人HIV感染者进入艾滋病中晚期的慢性感染过程,因此本研究选择灵芝制剂治疗猴获得性免疫缺陷综合征的疗效观察以感染SIV后17个月的猴为研究对象,有利于观察各项指标变化和疗效的判断。 HIV感染者和艾滋病患者接受抗病毒治疗3个月后,如果其CD4+T淋巴细胞增加30%,即可判药物治疗有效[7]。本研究中,实验开始时,治疗组猴 #374、#381和#393的CD4+T淋巴细胞计数分别为 285、451和368/μl。实验期间, #374除11、40和 47周外,其他各采样点均高于治疗前30% (292~ 550 /μl); #381波动幅度较大(222 ~ 623/μl); #393在实验开始后3·5个月死亡。推测本研究治疗组猴CD4+T淋巴细胞上升不够高的原因可能为: (1)机会性感染了真菌。
Kurnatosurski等[8]研究发现,真菌感染患者可出现T淋巴细胞功能失常和淋巴细胞数目下降。Delgade等[9]研究了147例抗病毒治疗失败的艾滋病患者,结果发现其中83例患者体内可分离出白色念珠菌, CD4+T淋巴细胞降至200 个细胞/mm3以下。(2)治疗组猴#381感染的巨细胞病毒也可导致CD4+T降低[10]。在人类艾滋病的高效抗逆转录病毒治疗中,一般治疗后3~4个月时,病毒载量即可降低至无法检测的水平,但随着治疗时间延长或停药,可出现病毒载量反弹[7]。本研究结果显示,实验开始时,治疗组猴#374、#381和#393的血浆病毒载量分别为 2·34×107、2·23×106和1·05×106copies/m;l实验期间, #374和#381缓慢下降,至实验结束时分别为 2·2×106和8·6×104copies/m,l在3个疗程停药期间血浆病毒载量均无明显反跳现象。#393在实验开始后3·5个月死亡,死亡时为2·04×106copies/m,l 对照组猴的病毒载量均有所上升。由此可见,灵芝制剂抗SIV的作用较慢,降低病毒幅度较小,停药后没有明显反跳。本研究对淋巴免疫器官的病理检查结果显示, 治疗组猴#374和#381的淋巴结和脾脏均趋向常态恢复,淋巴结边缘部皮质的淋巴细胞向其周围脂肪组织呈扩张性生长,胸腺重现, Ki67免疫组织化学染色结果为阳性,证实为新生的淋巴细胞和胸腺细胞, 提示淋巴免疫组织的重建。而对照组猴的淋巴组织呈耗竭状态,脾脏高度萎缩,胸腺消失。
此外本研究还见,治疗组猴淋巴结的NK和DC细胞都比正常猴明显增多,说明灵芝可能促进了NK和DC细胞的增殖。研究显示, NK细胞能通过膜肿瘤坏死因子家族分子与靶细胞膜配体结合导致靶细胞凋亡,还可以分泌干扰素γ对抗病毒感染。DC是一个很强的抗原提呈细胞,在病原的抗原摄取、提呈及特异性免疫激活中具有重要作用,是抗感染免疫的中心环节[11]。2003年, Lu等[12]采用单核源性DC细胞疫苗治疗SAIDS获得了良好的疗效。在猴SIV/SAIDS过程中,中枢神经受到侵犯[13]。神经组织可出现围管浸润、炎症、胶质细胞小结形成、软化灶等病变,这些病变在对照组猴较为多见。有研究采用灵芝总甾醇及其有效成分GS1 灌注大鼠大脑中动脉阻断缺血再灌注损伤模型,结果显示其对局灶性脑缺血再损伤有保护作用[1]。本研究将治疗组猴#374与对照组猴#361的丘脑、海马回、桥脑、延脑的神经核和脊髓前角相同核团的神经细胞进行比较,计算它们的无核神经细胞发生率, 结果显示治疗组猴#374和对照组猴#361下丘脑、海马、桥脑、延脑、脊髓的无核神经细胞发生率分别为18·46%和26·45%、3·8%和9·06%、25·35%和 48·5%、13·25%和50·0%、29·63%和56·52%, 对照组猴#361无核神经细胞发生率高于治疗组猴 #374,提示治疗组猴的神经细胞可能得到某些保护。
1998年,瑞典学者Eriksson等[14]发现成人海马神经细胞可再生。2003年,其又发现成人齿状回颗粒下层神经细胞再生[15]。2008年Johansson等[16]用生长激素诱导大鼠海马回的神经细胞增生并发现生长激素对神经细胞有保护作用。
本研究显示,在治疗组猴#347海马回和#381的海马回和扣带回出现增生的神经细胞, Ki67免疫组织化学染色为阳性,而对照组猴#361则无此现象。本研究还发现,治疗组猴的内分泌器官趋向常态恢复, #374和#381的脑垂体嗜酸性细胞胞质丰满,提示其内分泌功能良好。与脑垂体连系的3个轴的器官也出现恢复现象:甲状腺腺泡大小、形态和胶质成分都呈现恢复现象;肾上腺皮质和髓质也恢复常态,髓质的嗜铬细胞也恢复;卵巢各个阶段的卵泡发育趋向正常现象。对照组猴#348和#361的垂体嗜酸性细胞、嗜碱性细胞则高度萎缩,呈耗竭状态;垂体3个轴的器官也呈退变萎缩,甚至濒临耗竭的状态。
