本文作者：孙宏伟 元 野 杨晓敏 孙剑萍 单位：牡丹江烟草科学研究所 东北农业大学

由Pseudomonassyringaepv.tabai引起的烟草野火病是烟草上的主要叶部细菌病害，该病最早发现于美国的弗吉尼亚和北卡罗莱纳州，现已广泛分布于26个产烟国家和地区，造成了较严重的经济损失。目前该病主要用农用链霉素进行防治，品种较为单一，且经过连续多年的应用，病菌已产生抗药性。为经济有效地控制该病的发生与危害，对烟草内生拮抗野火病细菌进行筛选，既可以抑制病害，保护烟株，又可以防止由于化学农药的长期大量使用产生的“3R”问题，起到防病增产的效果［1-5］。为此，从烟草叶片中筛选出对烟草野火病菌（Pseudomonassyringaepv.tabaci）有显著抑制作用的拮抗菌株，通过16SrDNA确定拮抗菌的分类地位，测定其对烟草叶片内主要防御酶活性的影响，并对烟草成苗期野火病进行防治效果测定，旨在为新型生物农药的开发奠定基础。

1材料与方法

1.1试验材料供试烟草品种为龙江911。供试病原菌为烟草野火病菌Pseudomonassyringaepv.Tabai，由本所分离、鉴定并保存。供试培养基（NA）：牛肉膏3.0g，蛋白胨5g，葡萄糖2.5g，琼脂粉15g，蒸馏水1L，pH7.0~7.2。试验于2009年至2010年进行，地点设在牡丹江烟草科学研究所试验场（宁安市范家乡）烟田。试验育苗在大棚内进行，托盘育苗，塑料盘规格：45cm×65cm（120孔）营养土为山皮土、砂子、腐熟猪粪以1∶1∶1配比，高温熏蒸灭菌。大田试验烟苗5月10日移栽，按当地生产技术规范进行田间管理。

1.2烟草植株的采集及叶片中细菌的分离用灭菌打孔器（直径1cm）从烟田采集旺长期健康烟株的烟叶叶圆片，称取2g放置于灭菌研钵中加1mL无菌水研磨成匀浆，将匀浆10倍系列稀释至10-6倍，将10-4至10-5稀释液各取100μL涂于NA平板上，每浓度设3次重复，28℃培养2~3d。挑取不同类型的菌落，稀释后在NA平板上划线纯化培养后，挑取划线培养的单个菌落移入PDA斜面保存备用。

1.3烟草野火病菌拮抗细菌的筛选［2,4,6-7］菌株的活化及培养：将纯培养的病原菌和待测细菌培养物置于NA液体培养基中，28℃振荡培养48h后，配制成浓度为3×108cfu/mL的菌悬液备用。将5mL病原菌悬液混匀在NA固体培养基中倒为平板。用移液枪吸取70μL待测细菌菌悬液在平板上划线，28℃培养48~72h后观察抑菌效果，并测量抑菌带宽度。以未接菌的等量NA培养液代替待测细菌菌悬液为空白对照，重复3次。

1.4烟草野火病拮抗细菌的鉴定

1.4.1烟草野火病拮抗细菌纯培养物总DNA的提取及检测将供试拮抗菌株接种到马铃薯液体培养基中振荡培养至菌液浓度为1.8×108cfu/mL时（约24h），取1mL菌液加入到1.5mL离心管中，7500r/min离心5min，弃上清液，然后按照萨姆布鲁格的方法[8]提取烟草野火病拮抗细菌纯培养物总DNA。取DNA样品4μL在1%琼脂糖凝胶中电泳，EB染色，BIO-RAD凝胶影像分析系统（Bio-radQuantityOne4.1.0）观察并拍照。

1.4.2细菌16SrDNA的PCR扩增采用细菌16SrDNAV3区通用引物F338GC（5′-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3′）和R518（5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′）进行PCR扩增。反应总体积50μL的PCR扩增体系为：dNTP（10mmol/L）0.5μL，10×buffer（含MgCl2）5μL，引物F338GC（25μmol/L）1μL，引物R518（25μmol/L）1μL，Taq酶1μL，模板2μL，无菌去离子水39.5μL。PCR扩增条件为：94℃预变性5min；94℃变性10s，52℃退火20s，68℃延伸40s，35个循环；最后68℃下延伸7min。1.4.3PCR产物的琼脂糖凝胶电泳检测及比对将5μL扩增产物置于混有EB的1%琼脂糖凝胶上，在120V电压下电泳1h，BIO-RAD凝胶影像分析系统（Bio-radQuantityOne4.1.0）观察并拍照。将PCR产物由上海生工生物有限公司测序，测序结果与GenBank数据库中已报道的序列进行同源性比对。

1.5拮抗菌处理的烟草叶片主要防御酶活性测定试验设置拮抗菌诱导、烟草野火病菌（Pseudomonassyringaepv.tabai）接种、拮抗菌诱导后接种烟草野火病菌（Pseudomonassyringaepv.tabai）及清水对照4个处理，3次重复。在烟苗6～8叶期进行诱导，诱导后2d叶面喷雾接种病原菌，诱导后1，3，5，7，9，11，13和15d分别取样，于－20℃冰箱保存备用。

1.5.1苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性取各处理的烟草叶片0.5g，液氮研磨后，加入10mL预冷的0.1mol/L硼酸缓冲液［pH8.8，含1mmol/LEDTA、5mmol/L巯基乙醇、1%聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、1%甘油］混匀，在冷冻离心机中4℃，10000r/min离心25min，吸取上清液即为酶粗提液，加缓冲液定容至10mL。将酶粗提液分装于Eppendorff管中，于－20℃冰箱中保存备用。参照Mozzetti等［9］的方法，在试管中加入0.1mol/L硼酸缓冲液（pH8.8）4mL，0.02mmol/LL-苯丙氨酸2mL，酶粗提液200μL，对照用200μL缓冲液代替酶液，30℃温浴30min，290nm下比色，以每分钟引起吸光度值变化0.01所需的酶量（U1）为1个酶活性单位，取3次重复的平均值。计算公式：PAL活性=（ΔOD290nm•N）/（0.01•W•T•n•d）式中：N——酶粗提液总体积（mL）；W——样品鲜重（g）；T——反应时间（min）；n——反应液所用酶粗提液的体积（mL）；d——比色杯直径（cm），下同。

1.5.2过氧化物酶（POD）活性取各处理烟草叶片0.5g，经液氮研磨后，加入5mL预冷的0.5mmol/L磷酸缓冲液（pH6.0含1%PVP），在冷冻离心机中4℃，10000r/min离心20min，吸取上清液，即为酶粗提液，以下实验操作同PAL活性的测定方法。参考Hammerschmidt等［10］的方法，在试管中加入酶粗提液200μL，5mL10mmol/L磷酸缓冲液（pH6.0），0.25%愈创木酚0.2mL，100mmol/LH2O20.2mL，470nm下比色，以每分钟引起吸光度值变化所需的酶量（U2）为1个酶活性单位，取3次重复的平均值。计算公式：POD活性=（ΔOD470nm•N）/（W•T•n•d）

1.5.3多酚氧化酶（PPO）活性取各处理烟草叶片0.5g，用液氮研磨后，加入5ml预冷的0.2mmol/L磷酸缓冲液［pH6.0含1%聚乙烯吡咯烷酮（PVP）］，继续研磨成匀浆，样品在冷冻离心机中4℃，15000r/min离心20min，收集上清液即为酶粗提液，以下实验操作同PAL活性的测定方法。参考Hammerschmidt等［10］的方法，在试管中加入6mL0.2mol/L磷酸缓冲液（pH6.0），200μL酶粗提液，对照用200μL缓冲液代替酶液，混匀后于30℃水浴中保温10min，然后加入2mL0.2mol/L邻苯二酚，立即计时，398nm下比色，以每分钟引起吸光度变化所需的酶量（U3）为酶活性单位，取3次重复的平均值。计算公式：PPO活性=（ΔOD398nm•N）/（W•T•n•d）

1.6烟草野火病拮抗菌防治效果

1.6.1先处理后接病原菌的防治效果烟草野火病菌液的制配：挑取致病力强的烟草野火病菌放入装有500mLNA液体培养基的三角瓶中，于恒温振荡培养箱中28℃振荡培养48h，配制成浓度为3×108cfu/mL的菌悬液备用。拮抗菌液的制配：挑取抑菌效果最好的菌株放入装有500mLNA液体培养基的三角瓶中，于恒温振荡培养箱中28℃振荡培养48h，配制成浓度为3×108cfu/mL的菌悬液。试验设2个处理，1个空白对照，3次重复，9个小区，每小区100株成苗期烟株。处理A：农用链霉素，稀释5000倍，间隔24h喷雾2次；处理B：拮抗菌液喷雾，间隔24h喷雾2次；处理C（空白对照）：清水喷雾，间隔24h，喷雾2次。在处理后24h喷雾接种烟草野火病菌液。接种7d后调查各小区的病叶率。

1.6.2先接病原菌后实施处理的防治效果试验设2个处理，1个空白对照，4次重复，9个小区，每小区100株成苗期烟株。在各小区喷雾接种

1.6.1节中配制的烟草野火病菌液24h后，再对各小区进行处理。处理A：农用链霉素，稀释5000倍喷雾，间隔24h喷雾2次；处理B：已配制的拮抗菌液喷雾，间隔24h喷雾2次；处理C（空白对照）：清水喷雾，间隔24h喷雾2次。处理时及处理后7d分别调查各小区的病叶率。

1.6.3数据分析试验数据采用Excel进行方差分析，用Duncan新复极差法进行多重比较检验。

2结果与分析

2.1烟草野火病菌拮抗细菌的筛选从烟草叶片中共分离到287个细菌分离物，其中14个株对烟草野火病菌有一定的拮抗作用，其中抑菌效果最好的菌株为Y32，见图1和图2，其抑菌带宽度为9.3mm。

2.2烟草野火病菌拮抗细菌总DNA的提取总DNA的提取结果如图3所示。所得DNA条带片段集中，且无杂带，提取效果好，可进行下一步的PCR鉴定。

2.3烟草野火病菌拮抗细菌16SrDNA的检测及比对PCR产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果如图4所示，扩增片段即是目的片段，250bp左右。比对结果表明Y32与枯草芽孢杆菌MSB10的同源性为96%，证明该菌属于枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis。

2.4拮抗菌液对烟草叶片主要防御酶活性的影响［3］

2.4.1苯丙氨酸解氨酶（PAL）的活性烟草植株经拮抗菌液诱导、接种处理后苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性测定结果见图5。从图5可以看出，各处理PAL活性均高于对照，其中诱导后接种处理在处理9d时产生活性高峰，其峰值达60.60U1•g-1•cm-1，之后虽有所下降，但始终高于其他处理；诱导处理亦在9d时产生活性高峰，峰值接近于诱导后接种处理，11d后变化平稳；接种处理虽在处理7d时产生活性高峰，但比诱导和诱导后接种的处理酶活性低。说明拮抗Y32菌液有提高烟草PAL活性的作用。

2.4.2过氧化物酶（POD）的活性烟草植株经拮抗菌液诱导、接种处理后过氧化物酶（POD）活性测定结果见图6。从图6中可以看出，各处理POD的活性均明显高于对照，经诱导后接种的处理在7d时出现酶活峰值，虽在9d时有所下降，但始终维持在一个较高的水平；接种处理的POD活性虽在3d时迅速上升，但随后5~15d中的变化较缓慢，且始终低于诱导后接种处理。可初步认为在病原菌侵入前进行拮抗菌液诱导可显著提高烟草POD活性，增强烟草对病原菌的抗性。

2.4.3多酚氧化酶（PPO）的活性烟草植株经拮抗菌液诱导、接种处理后多酚氧化酶（PPO）活性测定结果见图7。从图7中可以看出，各处理PPO活性均高于对照。诱导后接种的处理在第3，9，13天时分别出现酶活性高峰，且自始至终高于其他处理；诱导、接种和对照处理的差距不大；各处理中，诱导和诱导后接种处理的酶活性变化相对较为平缓，接种处理酶活性产生波动，可见，诱导后接种可以保持较高水平且相对稳定的PPO活性，可以初步说明该菌液能够诱导提高烟草中PPO活性。

2.5拮抗菌对烟草野火病的防效影响

2.5.1先处理后接病原菌的防效连续实施2次A，B，C处理后，间隔24h喷雾接种野火病菌，结果见表1。表1结果表明野火病拮抗菌株Y32对成苗期烟草野火病的防治效果达97.54%，农用链霉素防治效果为41.44%，说明拮抗菌株Y32的防治效果显著高于农用链霉素的防治效果。

2.5.2先接病原菌后实施处理的防效接种野火病菌1d后连续2次间隔1d实施A,B,C3个处理。试验结果见表2。调查结果显示野火病拮抗菌株Y32对成苗期烟草野火病的防治效果达51.40%，农用链霉素防治效果为50.69%，说明拮抗菌株Y32的防治效果稍高于农用链霉素的防治效果。

3结论

（1）从烟草叶片中分离出的对烟草野火病菌（Pseudomonassyringaepv.Tabai）有显著抑制作用的细菌14株，其拮抗效果最好的菌株为Y32，抑菌带宽度为9.3mm，经16SrDNA序列鉴定该菌属于枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis。（2）烟草植株经Y32拮抗菌液诱导后接种，叶片内主要防御酶PAL，POD，PPO活性均显著增强，证明烟株喷施Y32菌株后能增强抗烟草野火病的能力。（3）野火病拮抗菌株Y32对烟草野火病具有较好的防治效果，对成苗期烟草野火病的防治效果为97.54%，而农用链霉素防治效果为41.44%，且后接病菌的处理防治效果显著高于先接病菌的处理，说明该菌珠对烟草野火病的预防作用较强。

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