本文作者：强 俊 杨 弘 王 辉 徐 跑 乐贻荣 何 杰 单位：南京农业大学无锡渔业学院 中国水产科学研究院淡水渔业研究中心 农业部淡水渔业和种质资源利用重点实验室 广东海洋大学水产学院

商品鱼的优质高产与饲料中必需营养成分的含量以及饲养环境紧密相关。蛋白质在饲料中所占比重较大，同时也是饲料中非常重要的营养成分之一。摄取蛋白质有助于鱼体组织更新与修复以及自身新陈代谢。饲料中蛋白质含量高于40%时，可以促进罗非鱼幼鱼生长［1］。饲料中蛋白质缺乏会影响罗非鱼生长速度、成活率［1］以及亲鱼性腺中卵黄的发育［2］、受精［3］等。因而，鱼类饲料中通常需要较高的蛋白质水平。同时，水生动物对饲料中蛋白质的需求与水温［4］、盐度［5］、鱼的规格［6］与饲养密度［7］、饲料中的脂肪水平［8］与能量［9］以及蛋白质源［10］等密切联系。水温是水产养殖中重要的影响因子，对水生动物机体和水体中的生化反应有直接影响。Singh等［11］研究发现，在水温为28～32℃时，麦瑞加拉鲮鱼(Cirrhinusmrigala)的饲料中蛋白质需求量为36%，而蛋白质利用率在饲料蛋白质水平为28%时较高;鲈鱼(Dicentrarchuslabrax)在15和20℃水温下最优饲料蛋白质水平均为50%，然而20℃时，蛋白质的利用与摄食率明显高于15℃时的［12］。可见，提高温度有助于提高鱼类的能量代谢。关于不同水温与饲料蛋白质水平对罗非鱼的影响方面，仅见Musuka等［13］对伦氏罗非鱼(T．rendalli)的研究。Musuka等［13］研究发现，饲料蛋白质水平为30%时，伦氏罗非鱼在水温为26℃时生长较快，而蛋白质水平为40%时，伦氏罗非鱼在30℃时生长较优。神经内分泌因子对鱼类的生长和能量代谢起调控作用。生长激素(GH)、胰岛素样生长因子－Ⅰ(IGF-Ⅰ)和胰岛素作为3个重要的神经内分泌因子，在代谢与促进生长方面发挥着重要作用［14］。GH水平可以直接影响肝脏中IGF-Ⅰ的分泌。同时，这些激素的产生与分泌受许多外源因子(如:饲料中的营养成分、温度、盐度、光照与季节变化等)直接或间接调控［15－19］。增加温度可以提高大菱鲆(Scophthalmusmaximus)［17］和大马哈鱼(On-corhynchustshawytscha)［20］血浆IGF-Ⅰ水平与虹鳟(Oncorhynchusmykiss)［18］血浆GH水平;饲料蛋白质水平也与GH、IGF-Ⅰ水平密切相关。然而，关于温度与饲料蛋白质水平对罗非鱼生长、饲料效率和血清GH水平的互作效应以及生长、饲料效率和血清GH水平之间的相互关系上，尚未见到相关研究。本研究旨在采用中心复合试验设计与响应曲面分析方法研究水温与饲料蛋白质水平对吉富品系尼罗罗非鱼(Oreochromisnilotica)幼鱼生长、饲料效率与血清GH水平的联合影响，并对各因子的二次效应及其交互作用作进一步地研究和探讨。中心复合设计与响应曲面法是近年来应用较多的过程优化的综合技术，本研究中拟用来建立因子与响应间关系的曲面模型，并对影响生物过程的因子及其交互作用进行评价，同时，对生长、饲料效率与血清GH水平之间相关性进行考察，旨在为吉富品系尼罗罗非鱼的高产与健康养殖提供科学依据。

1材料与方法

1．1试验用鱼试验鱼采自中国水产科学研究院淡水渔业研究中心宜兴基地自繁的第16代吉富品系尼罗罗非鱼幼鱼，选择无病无伤，活力强的个体作为试验用鱼。试验前在室内水泥池［水温(27．0±0．3)℃)、pH(7．4±0．2)］中暂养10d，自然光周期。暂养期间使用循环水连续充气，每天07:00、11:00和16:00各投喂沉水性饲料1次(粗蛋白质为38．0%、脂肪为8．0%)，投喂量为体重的8%。

1．2试验设计与分组试验采用中心复合试验设计，本试验的响应值为特定生长率、饲料效率和血清GH水平，因子为温度(20～34℃)和饲料蛋白质水平(25%～50%)，分别以T和P表示，每个因子的试验水平编码分别为－a、－1、0、1、a(表1)，试验采用2因素5水平，共计13次试验，试验的次序随机，中心组合重复5次，每个试验组合重复3次。温度和饲料蛋白质水平试验组合设计见表1。

1．3试验饲料试验饲料参照文献［6］进行配制，饲料组成及营养水平见表2。

1．4试验鱼的驯化试验鱼先进行温度驯化，驯化在1．2m3塑料桶中进行，用电子恒温棒(量程为18～36℃)控温，温差为0．3℃。温度驯化采用渐进方式，每天温度升降幅不超过2℃。驯化至相应的温度后，在此设置下饲养7d。

1．5试验方法试验自2011年11月1日至2011年12月26日，共计56d。试验在39个1．2m3塑料桶中进行，每个塑料桶添加曝气3d后的自来水1m3，每个试验桶放置1个300W的潜水泵，用于水体的循环与过滤。调节至相应的温度，试验开始前对幼鱼的体重和体长进行测量，平均体重为(27．64±1．29)g，体长为(9．43±0．46)cm，每个试验组合共放置45尾鱼，每个平行组各15尾鱼。各组初始体重和体长均没有显著差异(P＞0．05)。按照表1的组合投喂不同的蛋白质水平饲料，每次定量投喂(保证桶底无饲料残留)，日投喂量为体重的3%～7%。试验期间连续充气，采用虹吸法清除桶底粪便，日换水量1/3，保持换水前后温差不超过0．3℃，溶氧保持在5mg/L以上，pH(7．6±0．2)，氨氮和亚硝酸盐分别不高于0．01mg/L，自然光周期。

1．6响应指标测定试验结束前24h停饲，次日对每个试验组合的全部试验用鱼进行体重测量，特定生长率(SGR，%/d)=100×［(lnW2－lnW1)/(t2－t1)］;饲料效率(FE，%)=100×(W2－W1)/F，式中:W1、W2分别为起始时间t1、终末时间t2时的体重(g)、F为总投饵量(g)。试验结束后，每个养殖桶随机选取5尾鱼，用200mg/L的MS-222作快速深度麻醉，尾静脉采血。血样于4℃冰箱中静置2h，在4℃，3500×g离心10min制备血清，上清液移置－80℃冰箱中保存备用。血清GH水平测定采用同种(类)放射免疫分析法(RIA)，具体参照Ayson等［21］。1．7数据分析数据测定结果用平均值±标准差(mean±SD)表示。通过最小二乘法拟合因子与响应值之间的二次多项回归方程为:Y^=b0+b1T+b2P+b3T×P+b4T2+b5P2。式中:Y^为响应预测，在此响应为特定生长率、饲料效率、血清GH水平;b0、b1、b2、b3、b4、b5分别为回归常数、温度与饲料蛋白质水平的一次效应、温度与饲料蛋白质水平间互作效应、温度与饲料蛋白质水平的二次效应。采用STATISTICA8．0软件进行试验设计与结果处理，对温度、饲料蛋白质水平与响应值进行二次多项回归拟合。特定生长率、饲料效率与血清GH水平之间的相关性分析采用SPSS15．0中的Pearson相关分析法。显著水平为0．05，极显著水平为0．01。

2结果

2．1响应值响应指标测定结果见表3。

2．2温度与饲料蛋白质水平对吉富品系尼罗罗非鱼幼鱼特定生长率的影响温度(T)与饲料蛋白质水平(P)对罗非鱼幼鱼特定生长率(SGR)影响的测定结果见表3，对数据采用最小二乘法进行回归拟合，回归方程系数显著性检验结果列于表4。从表4可见，模型P=0．0001＜0．01，表明所建立的回归模型极显著;失拟项P=0．0993＞0．05，表明拟合的模型有效。T的一次与二次效应、P的一次效应对特定生长率有极显著影响(P＜0．01)(表5)，P的二次和T×P对特定生长率无显著影响(P＞0．05)。回归系数显示，温度的效应较饲料蛋白质水平明显。T和P与SGR之间的实际二次回归方程(1):SGR=－8．808+0．583T+0．093P+0．001T×P－0．01T2－0．001P2。该方程的决定系数R2=0．958，说明该模型能解释95．8%响应值的变化，仅有总变异的4．2%不能用此模型解释，该模型拟合程度良好。温度与饲料蛋白质水平和特定生长率之间的响应曲面图及其等高线图见图1－a和图1－b。通过该组动态图可评价试验因素对幼鱼生长的两两交互作用。本试验条件下，随着温度升高，特定生长率呈先上升后下降的变化趋势。饲料蛋白质水平为37．5%时，幼鱼在水温为31～33℃环境下生长较快。当饲料蛋白质水平为25%～45%时，特定生长率随蛋白质水平的升高而升高，饲料蛋白质水平高于45%时，特定生长率缓慢下降。水温为27℃时，饲料蛋白质水平为45%时，幼鱼的特定生长率为2．565%/d，显著高于25%时的1．989%/d(P＜0．05)。

2．3温度与饲料蛋白质水平对吉富品系尼罗罗非鱼幼鱼饲料效率的影响温度(T)与饲料蛋白质水平(P)对罗非鱼幼鱼饲料效率(FE)影响的测定结果见表3，对数据采用最小二乘法进行回归拟合，方差分析结果列于表6。从表6可见，模型P=0．0001＜0．01，表明所建立的回归模型极显著;失拟项P=0．1231﹥0．05，表明拟合的模型有效。T的一次效应、T和P的二次效应与T×P对FE有极显著影响(P＜0．01)(表7)，P的一次效应对FE有显著影响(P＜0．05)。回归系数显示，温度的效应较饲料蛋白质水平明显。T和P与FE之间的实际二次回归方程(2):FE=－5．7582+0．3303T+0．0929P－0．0015T×P－0．0047T2－0．0007P2。该方程的决定系数R2=0．955，说明该模型能解释95．5%响应值的变化，仅有总变异的4．5%不能用此模型解释，该模型拟合程度良好。温度与饲料蛋白质水平和饲料效率的响应曲面及其等高线图见图2－a和图2－b。本试验条件下，饲料蛋白质水平为37．5%，温度为20～29℃时，随着温度升高，饲料效率呈上升趋势。温度对饲料效率有极显著影响(P＜0．05)，温度高于29℃时，饲料效率明显下降;温度为27℃，饲料蛋白质水平为25%～40%时，饲料效率逐渐升高，蛋白质水平高于40%时，饲料效率开始下降。温度与饲料蛋白质水平分别为28．9℃和38．2%时，饲料效率较高，为0．786，其可靠性为0．959。2．4温度与饲料蛋白质水平对吉富品系尼罗罗非鱼幼鱼血清GH水平的影响温度(T)与饲料蛋白质水平(P)对罗非鱼幼鱼血清GH水平(GH)影响的测定结果见表3，对数据采用最小二乘法进行回归拟合，方差分析结果列于表8。从表8可见，模型P=0．0046＜0．01，表明所建立的回归模型极显著;失拟项P=0．3695﹥0．05，表明拟合的模型有效。T的一次效应、T和P的二次效应与T×P对GH有显著影响(P＜0．05)(表9)，P的一次效应与对GH有极显著影响(P＜0．01)。回归系数显示，温度的效应较饲料蛋白质明显。T和P与GH之间的实际二次回归方程(3):GH=－12．6845+0．7364T+0．2675P－0．0051T×P－0．0093T2－0．0021P2。该方程的决定系数R2=0．875，说明该模型能解释87．5%响应值的变化，仅有总变异的12．5%不能用此模型解释，该模型拟合程度良好。温度与饲料蛋白质水平对血清GH的响应曲面及其等高线图见图3－a和图3－b。本试验条件下，饲料蛋白质水平为37．5%，温度为20～29℃时，随着温度升高，血清GH水平呈上升趋势;温度对血清GH水平有显著影响(P＜0．05)，温度高于29℃时，血清GH水平开始下降。温度为27℃，饲料蛋白质水平为25%～32%时，血清GH水平呈上升趋势，但变化较小，基本在2．37～2．40ng/mL;蛋白质水平高于32%时，血清GH水平显著下降(P＜0．01)，蛋白质水平为50%时，血清GH水平仅为1．648ng/mL。2．5响应优化按照文献［22］的方法，对生长和饲料效率同时优化，获得温度与饲料蛋白质水平的最优组合为29．9℃和40．3%，在此最优组合条件下，特定生长率与饲料效率的最优预测值分别为2．748%/d和77．5%，其可靠性达0．888。2．6吉富品系尼罗罗非鱼血清GH水平与特定生长率、饲料效率的关系本试验条件下，血清GH水平与罗非鱼幼鱼的特定生长率之间的模型为GH=0．3684SGR+1．2691，r=0．441(P＞0．05)(图4－A)，无明显相关性;与饲料效率之间的模型为GH=1．9843FE+0．7806，r=0．668(P＜0．05)(图4－B)，有正相关性。

3讨论

水温对鱼类的食物消耗有重要影响。较高的温度有助于提高鱼类的摄食和饲料利用，促进肠道的消化和吸收［13］。本研究中，水温的变化对罗非鱼的生长和饲料效率有显著影响，升高温度有助于提高其生长与饲料利用，当饲料蛋白质水平为37．5%，水温为27℃时，罗非鱼的特定生长率为2．378%/d～2．597%/d，饲料效率为74．1%～80．3%，显著高于水温为20℃时的1．408%/d和39．1%。响应曲面分析表明，当饲料蛋白质水平为37．5%时，水温在30．2℃，罗非鱼幼鱼生长与饲料效率同时达到最优，分别为2．706%/d和77．9%，可靠性为0．879。Musuka等［13］研究发现，饲料蛋白质水平为40%时，伦氏罗非鱼在水温为30℃条件下的特定生长率与饲料效率均显著高于水温为22．89℃时的，这与本研究的结论相似，也在Popma等［25］所报道的罗非鱼最优生长水温在29～31℃。可见，最优水温有助于增加食欲，维持体内需求的能量较少，因而，促进鱼体快速有效地生长。温度高于33℃时，较高的温度对鱼体产生了生理应激，代谢产生的能量主要用于维持机体的衡态，从而导致生长与饲料效率的下降［13］。本研究中，随着饲料蛋白质水平的上升，罗非鱼显示出更优的生长速度。水温为27℃，蛋白质水平为45%时，罗非鱼的特定生长率为2．565%/d，显著高于蛋白质水平为25%时的1．989%/d。45%蛋白质水平对生长无抑制作用。胡国成等［23］也发现，饲料蛋白质水平为23．1%～47．9%时，新吉富罗非鱼的特定增重率随蛋白质水平升高而上升。然而，这与Abdel-Tawwab等［6］的研究结果有所差异。Abel-Tawwab等［6］发现，水温为27℃时，蛋白质水平为35%时，特定生长率为1．143%/d，高于25%时的1．007%/d和45%时的1．107%/d。罗非鱼生长中最优蛋白质需求的变化可能与其饲养密度、品系与选育代数以及环境条件密切相关［1］。本试验所选用的尼罗罗非鱼为吉富第16代罗非鱼，并在中国宜兴试验基地采用群体选育法进一步选育了4代。试验中同时发现，当水温为27℃，蛋白质水平为50%时，罗非鱼的特定生长率有所下降，为2．533%/d，饲料中高蛋白质水平对生长出现了抑制作用。Juancey［24］也发现，饲料中蛋白质含量为56%时，莫桑比克罗非鱼(O．mossambicus)的生长速度低于蛋白质含量为48%时的生长速度。蛋白质水平为25%时，可能由于大部分蛋白质用于维持机体自身能量需求，用于生长的较少。饲料蛋白质水平对罗非鱼幼鱼的饲料利用有显著影响，较高的蛋白质水平有助于提高其肠道与肝胰脏的蛋白酶活性［26］。本试验中，水温为27℃，蛋白质水平为25%～40%时，饲料效率随蛋白质水平升高而升高，这与AlHafedh［1］的研究结果相似。饲料蛋白质水平高于40%时，饲料效率随蛋白质水平的升高而降低，Abel-Tawwab等［6］也发现了类似结论，这可能是因为饲料中蛋白质水平超出罗非鱼的需求范围，过量的氨基酸无法被正常吸收，饲料中的蛋白质被用于鱼体代谢，转化为脂肪在组织和肌肉中沉积，或增加尿液中氮的排泄，造成蛋白质浪费［27］。硬骨鱼的能量代谢与生长是通过一个复杂的内分泌系统来调节的，内分泌系统中包括各种激素，血清GH与IGF-Ⅰ在其中发挥着重要作用。GH与IGF-Ⅰ具有代谢调节和生长促进功能，GH可以刺激肝脏中IGF-Ⅰ分泌，而循环IGF-Ⅰ水平又转而调节GH的合成与释放［14］。温度、盐度、季节变化与饲料营养对GH也起调控作用。本试验中，罗非鱼血清GH水平与饲养水温的变化密切相关。较高的温度有助于增加血液中GH水平，在虹鳟［28］的研究中也发现类似结论。可能归因于水温对新陈代谢水平的调控(如葡萄糖、氨基酸、脂肪酸等)，通过胰腺生长激素抑制素或者下丘脑器官直接或间接调节GH分泌［28］。同时，光照周期较长时(如夏季)，可能会使水温升高，进而影响血液中GH水平，在罗非鱼［29］、比目鱼(Pleuronectesplatessa)［30］和大西洋鲑(Salmosalar)［31］中见到相关报道。需要注意的是，光照周期对其是否有影响还需要进一步研究。当水温超出罗非鱼的适宜范围时，高温可能对某些代谢途径产生了抑制作用，从而可能减少GH分泌。同时，本试验中发现，血清GH水平与特定生长率之间无显著相关性，相关系数仅为0．441。可见，血清GH水平与生长之间可能无直接联系。邓利等［32］也认为，血清GH并非直接调控生长，还取决于循环GH的清除率、GH靶组织上GH受体数量和亲和力的变化以及与IGF-Ⅰ的相互作用等。本研究首次发现，血清GH水平与饲料效率之间呈显著正相关，r=0．668。血清GH可能对罗非鱼的饲料利用有调节作用。注射GH激素可以提高鱼类的生长速度，促进蛋白质合成，同时，GH也可以降低体内脂肪蓄积，增加脂肪的利用［28］。本试验中发现，饲料蛋白质水平对罗非鱼幼鱼血清GH水平有显著影响。饲料蛋白质水平为25%～32%时，罗非鱼血清GH水平变化较小，基本在2．37～2．40ng/mL，这与Shepherd等［33］的研究结论相似。Shepherd等［33］发现，饲料蛋白质水平分别为35%和25%时，对莫桑比克罗非鱼血清GH水平无显著影响。饲料蛋白质水平高于32%时，罗非鱼血清GH水平开始下降，GH与饲料蛋白质水平呈负相关。在其他硬骨鱼，如虹鳟［34］和翘嘴鮊(Culteralburnus)［35］的研究中也发现类似结论。随着饲料蛋白质水平的上升，可能会降低循环的生长激素水平与肝脏中生长激素受体结合位点，从而引起血清GH水平下降［35］。GH可以调控IGF-Ⅰ的含量，IGF-Ⅰ通过影响蛋白质合成时转录模板DNA含量、转录效率和翻译水平，从而实现对鱼体蛋白质的调控［36］。血液IGF-Ⅰ水平通常与生长呈正相关。高饲料蛋白质时，可能通过GH影响血清IGF-Ⅰ水平来抑制生长。同时，饲料蛋白质源对血清GH水平也有明显影响。Gómez-Requeni等［37］与王桂芹等［35］用植物蛋白替代鱼粉可以降低金头鲷(Sparusaura-ta)和翘嘴鮊生长速度，提高其血液中GH水平。本研究首次发现，温度与饲料蛋白质水平对罗非鱼幼鱼的饲料效率和血清GH水平存在互作效应，而对特定生长率无互作效应。最优饲料效率随温度与饲料蛋白质水平的改变而改变。温度为20℃，罗非鱼幼鱼在饲料蛋白质水平为46%～48%时，拥有最佳饲料效率，此时，血清GH水平在蛋白质水平为39%～41%时较高;随着温度上升，温度为27℃，饲料蛋白质水平为40%～42%时，饲料效率最佳，而血清GH水平在蛋白质水平为31%时较高;温度为34℃，饲料效率在蛋白质水平为32%时较好，血清GH水平在蛋白质水平为25%时较高。水温对罗非鱼生长的蛋白质需求有显著影响，这可能是因为水温较低时，罗非鱼的蛋白需求量较高，机体需要利用较多的氨基酸来维持能量需求;温度为27℃时，水温可能较适宜于鱼体生存，机体能量需求降低，减少了对饲料蛋白质的需求;而高温环境会对鱼体产生生理应激，抑制体内蛋白酶的活性［38］，造成蛋白质浪费。温度与饲料蛋白质水平对特定生长率无互作效应，可能是因为在本试验所设计的饲料蛋白质范围内，不同温度下，特定生长率的变化趋势基本相同。本试验所采用的试验设计和分析方法可以较好地将温度与饲料蛋白质水平在整个试验范围内的变化以及因子间的互作效应进行分析，并且建立相关的曲面模型。模型的建立是为了更好地分析与预测因子和响应值间的关系。本试验中，采用最小二乘法进行回归拟合，模型都达到了较优的拟合度。温度和饲料蛋白质水平与特定生长率、饲料效率和血清GH水平的模型决定系数分别达到0．958、0．955和0．875，影响极显著。同时，通过对因子二次效应峰值的考察，能够很好地建立因子的最优组合。当温度与饲料蛋白质水平分别为29．9℃和40．3%时，罗非鱼幼鱼的特定生长率与饲料效率同时达到最高，分别为2．748%/d和77．5%。然而，在实际生产中，随着鱼粉价格的上涨，较高的蛋白质水平可能会带来养殖成本的增加。提高饲料脂肪水平或建立最优蛋白质与碳水化合物比例可能有助于提高饲料中氮的利用，减少蛋白质浪费。同时应该注意其他环境因子，如盐度、酸碱度、溶氧和光照等，对罗非鱼饲料蛋白质的利用上可能存在影响，需要进一步研究。

4结论

①温度与饲料蛋白质水平对吉富罗非鱼生长、饲料效率和血清GH水平有显著影响，其中对饲料效率和血清GH水平的影响效应中存在互作效应。温度/饲料蛋白水平为29．9℃/40．3%时，特定生长率与饲料效率同时达到最优，分别为2．748%/d和77．5%。温度对特定生长率与饲料效率的影响较饲料蛋白质明显。②特定生长率与血清GH之间相关性较差，血清GH对生长不起直接调控作用，而血清GH与饲料效率之间呈显著正相关，血清GH的增加可以提高罗非鱼的饲料效率。

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