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胚胎是由继承了父方与母方双重组织特性的受精卵发育而来, 对母体而言是一种半同种异体移植物, 但是在正常妊娠期间并未发生母胎排斥现象,这主要依赖于母胎免疫耐受的建立, 早期妊娠失败多因母体对胚胎免疫排斥所致。尽管对母胎免疫耐受的机制进行了广泛研究, 但父方表达的印记基因是否在这方面发挥作用仍不清楚。我们前期的研究工作显示, 父方来源表达的印记基因 PEG10 (Pa-ternally expressed gene 10)在正常妊娠蜕膜组织中高表达, 这为研究母胎界面免疫耐受机制提供了新的切入点。

我们在正常妊娠细胞滋养层细胞(Cytotrophoblasts,CTB) 和绒毛外滋养层细胞(Extravillous trophpblast,EVT)基因表达谱(Affymetrix 芯片)中发现, 有许多基因高表达, PEG10 就是其中之一。此外, Nakamura等通过基因敲除的方法发现小鼠PEG10 缺乏所致胎盘功能缺陷而产生早期胚胎致死现象, 这些结果提示 PEG10 在妊娠中有重要作用。近年来, 在肿瘤方面对 PEG10 基因有大量的研究报道，而PEG10 基因是否在人类妊娠过程中发挥作用尚未见报道。因此, 本实验通过 RT-PCR、原位杂交、免疫组织化学及 Western blot 技术分析 PEG10 mRNA 及蛋白在难免流产患者和正常妊娠妇女蜕膜组织的表达水平, 以探索父方来源表达的印记基因在母胎免疫耐受建立中的作用和意义, 为研究难免流产的分子机制提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 研究对象和分组

选取 2006 年 12 月至 2007 年 6 月在重庆医科大学第一附属医院妇产科门诊接受难免流产清宫术的妇女 36 例作为研究对象。孕 7～9 周, 年龄 20～35岁, 经妇科检查、B 超诊断而确认为难免流产胚胎停育者(包括胚囊小于孕周或未见胚芽或未见原始心管搏动)。同时,选取同期在我院自愿中止妊娠的健康妇女 36 例作为对照。年龄 20～32 岁, 停经 7～9 周,经妇科检查、B 超证实为宫内妊娠且符合孕周。所有研究对象均身体健康, 月经规律(月经周期为28～30 d), 3 个月内未服用甾体类药物, 未放置宫内节育器。同时男方精液正常, 夫妇染色体核型正常,无遗传病史, 无产道异常及免疫系统异常, 无既往自然流产和死胎死产史。所有研究对象均签署知情同意书。

1.1.2 主要试剂

Trizol 试剂盒 (Invitrogen), M-MLV 逆转录酶(Promega), PCR 试剂(TaKaRa), 琼脂糖(Sigma)。地高辛标记的cDNA探针及超敏型原位杂交试剂盒(北京鼎国生物公司)。兔抗人 PEG10 多抗(武汉博士德公司), 免疫组化染色试剂盒(SP-9000)、DAB 显色试剂盒及羊抗兔二抗(北京中杉公司)。

1.2 方法

1.2.1 RT-PCR 法测定 PEG10 mRNA

按Trizol试剂盒操作程序提取蜕膜组织总RNA,取部分 RNA 进行琼脂糖凝胶电泳, 观察其完整性。紫外分光光度计测定 RNA 的 A260与 A280值, 并计算A260/A280,判断 RNA 纯度及计算其浓度。以 Oligo(dT)为引物进行逆转录, 操作按 Promega 逆转录试剂盒进行。根据 PEG10 编码序列设计引物, 序列为 P1:5′-GCTACCACTGCCGGATGTAT-3′, P2: 5′-GCCAC-AAAATCTCGAAGAGC-3′。以  -actin 作为内对照,其引物由 Invitrogen 公司设计合成。序列为 P3:5′-GAGCTACGAGCTGCCTGACG-3′, P4: 5′-CCTA-GAAGCATTTGCGGTGG-3′。PEG10 基因扩增片段长度为 277 bp,  -actin 基因扩增片段长度为 466 bp。PCR 扩增按 TaKaRa 试剂盒操作, 扩增参数如下: 94℃预变性 4 min, 然后进入循环; 94℃ 35 s, 56℃ 45s, 72℃ 90 s, 30 个循环; 最后再 72℃ 延伸 10 min。取 PCR 产物 5 μL 加 6×loading buffer 1 μL, 1.5％琼脂糖凝胶电泳, Bio-Rad 凝胶成像系统摄像。

运用 Quantity one 凝胶分析软件系统(Bio-Rad)分析每个样本 PEG10 与  -actin 的扩增产物凝胶图像, 测出二者吸光度及其比值, 该比值即为 PEG10mRNA 相对表达值。

1.2.2 原位杂交检测 PEG10 mRNA

取新鲜蜕膜组织, 用 DEPC 处理过的生理盐水冲洗后, 4％多聚甲醛固定, 梯度酒精脱水, 常规石蜡包埋切片, 6 μm 连续切片。PEG10 寡核苷酸探针:5′-GACATGCTGGCTCCTTTCATGGCCCAGTGCC-AGATCTTCATGGAAAAGAG-3′( 美 国 ABI 公 司3948 型引物合成软件设计), 北京鼎国生物公司合成并在 5′末端用地高辛标记。杂交过程严格按照试剂盒说明书操作, 探针工作浓度为 40 ng/μL, 消化时间 8 min, 以不加探针的杂交液作阴性对照, 以试剂盒自带的阳性对照探针作阳性对照。用 NBT/BCIP显色系统显色, 显色时间 32 min。核固红复染, 常规脱水、透明、封片。采用 NikonTE-2000 成像系统摄像。

运用北航真彩医学分析软件系统对每张切片随机选取 5 个高倍视野(200×), 测定蜕膜组织 PEG10mRNA 表达的面积积分光密度值(A 值), 以 5 个高倍视野的均值作为该标本的代表值。

1.2.3 免疫组织化学检测 PEG10 蛋白水平用原位杂交处理好的石蜡组织切片。采用 S-P法, 一抗工作浓度均为 1:50, 用 PBS 代替一抗作空白对照, DAB 显色, 苏木精复染。光镜下, PEG10 蛋白在蜕膜间质细胞和腺上皮细胞胞浆表达, 胞核不着色。采用 NikonTE-2000 成像系统摄像。

每组标本取 10 张切片, 每张切片 3 个视野, 以视野数为单位, 每个标本共 30 个视野。根据细胞着色强度分为 4 级: 细胞无着色为阴性; 细胞浅黄色为弱阳性; 细胞棕黄色为中度阳性; 细胞棕褐色为强阳性。同时运用北航真彩医学分析软件进行测量分析, 选取阳性平均光密度值为半定量参数, 测定PEG10 蛋白的相对表达量。

1.2.4 Western blot 检测 PEG10 蛋白水平

蜕膜组织总蛋白按 Tripure 试剂盒操作, 以牛血清白蛋白(BSA)作为标准品, 根据蛋白定量试剂盒(Pierce)说明绘制蛋白定量标准曲线 , 计算蛋白浓度。等量上样 PAGE 分离, 半干转移系统转膜, 将PAGE 分离的蛋白转到 PVDF 膜上, PEG10 抗体稀释浓度 1:100, β-actin(43 kDa)抗体稀释浓度 1:200, 辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗稀释浓度 1:2 000,DAB 方法显色, Bio-Rad 成像系统摄像。

运用 Quantity One 4.0 软件分析各条带强度的光密度值, 以 PEG10/ β-actin 光密度比值作为目的蛋白的相对含量。

1.3 统计学处理

数据以 x ± s 表示, 采用 SPSS12.0 软件进行统计分析, 组间比较采用 t 检验, P＜0.05 有意义。