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摘要:从30个随机引物中筛选出5条,对哈萨克羊、蒙古羊、兰州大尾羊、同羊、大尾寒羊、小尾寒羊共6个绵羊品种的 基因组进行扩增分析,然后用6种聚类方法(欧氏距离、夹角余弦、皮尔逊相关、车贝雪夫距离、街区距离、明考夫斯基) 进行聚类。结果表明,分布在我国西北部的绵羊品种以及大尾寒羊在大多数情况下总是先聚在一起,相对分布于中原 地带的同羊、小尾寒羊总是和西北部的品种间距离较远。同羊和小尾寒羊之间距离也很远,较接近品种志中的记载。 6种聚类方法均可。

关键词:畜牧、兽医科学基础学科;聚类;随机扩增多态DNA;绵羊

据联合国粮农组织(FAO)统计,世界绵羊(Ovis)品种或 类群多达600多个,大约在10亿只以上,分布于150多个国 家。已查明,在20世纪30年代以来,灭绝的绵羊品种至少有 20个,且有50个处于濒危状态;中国固有的绵羊品种约34 个,处于濒危状态的有24个;由此可见绵羊遗传资源的保护 工作已刻不容缓。为此,近20年来,我国不少学者不但从细 胞学水平、生化水平对绵羊的遗传多样性进行了研究,而且在 分子水平也进行了一定探索[1~4],但涉及到本研究中的品种 很少,因此本研究的目的是通过RAPD标记,探讨6个中国地 方绵羊品种间的遗传关系,为今后的遗传资源保存利用、杂交 改良某些经济性状提供遗传学依据。

1　材料与方法

1.1　材料

1.1.1　血样来源与保存:采用随机典型抽样法于受试绵羊品 种中心产区进行个体采样,左侧静脉处采集10ml血样,-20℃ 保存。6个绵羊品种分别为蒙古羊(MG)31只采自内蒙古阿 左旗,同羊(TZ)37只采自陕西白水县和陕西蒲城县,兰州大 尾羊(LD)31只采自甘肃省兰州市郊,小尾寒羊(XW)40只采 自河南台前县,大尾寒羊(DW)30只采自河南宝丰县,哈萨克 羊(HK)30只采自新疆。 1.1.2　引物与试剂:30条随机引物购自上海生工生物工程技 术服务有限公司;普通试剂购自华美生物工程公司。

1.2　方法

1.2.1 DNA提取与PCR扩增:参照卢圣栋[5]的方法进行提取 DNA。PCR反应程序为:94℃,2 min→45×(90℃,30s;36℃,1 min;72℃,2min)→72℃,10 min, 4℃保存。RAPD反应体系 (25μl):10×buffer 2.5μl,dNTPs 2 mmol/L,Mg2+2 mmol/L, Primer 2μmol/L, TaqDNA聚合酶1U,模板100 ng。

1.2.2　电泳检测:1.2%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物,EB 染色,在Kodak凝胶成像系统成像分析。

1.2.3　分析方法和系统聚类:对我国6个固有绵羊品种间距 离的计算,采用的Nearest Neighbor下的6种聚类方法,分别为 欧氏距离(Euclidean)、夹角余弦(Cosine)、皮尔逊相关(Pearson Correlation)、车贝雪夫距离(Chebychev)、街区距离(City Block)、 明考夫斯基(Minkowski),距离计算和系统聚类借助于SPSS10. 0软件进行。

2　结果与分析

2.1　RAPD扩增结果　从30条引物中筛选出扩增条带多、重 复性好、分率高的引物5条(0424 - 198、CY0814、CY0818、 OPW19、OPQ05)进行扩增。根据扩增结果,算出带纹相似率, 然后聚类分析。

2.2　距离计算与系统发生树

2.2.1　欧氏距离　

2.2.2　夹角余弦

3　讨论

3.1　6个绵羊品种的历史渊源　据《中国羊品种志》描述[6], 大尾寒羊是从异域引入的,康居大尾羊(今中亚和近东地区) 与分布于陕西的同羊,河南、山东的大尾寒羊相象;推断是经 由新疆哈密进入甘肃东部,然后又达陕西大荔和中原地带,长 期在优越的生态环境和当地人民的选育形成了有同源关系的 绵羊品种;在陕西为同羊,在中原为大尾寒羊。兰州大尾羊是 清同治(公元1862~1875)年间,群众从同洲(陕西大荔一带) 购来同羊与当地绵羊(伏地羊)杂交的后代。小尾寒羊是分布 在中原地区的蒙古羊,在雨量充沛、饲料丰富、气候暖和的自 然生态条件影响下,形成了发育快、繁殖力高的小尾寒羊。哈 萨克羊被认为是肥臀羊或古籍所述的大尾羊,与前苏联的哈 萨克斯坦的肥臀羊同源。陈玉林(1999)[7]认为,大尾寒羊和 小尾寒羊的起源问题说法较多,尚无定论。

3.2　6个绵羊品种的遗传关系分析　根据以上的分析可以 看出,如果用本研究所选的5个引物对这6个品种进行聚类 分析是完全可行的。在几种聚类法中以街区距离法最为适 宜,因为街区距离法的聚类结果最为切合这6个绵羊品种渊 源之说。即兰州大尾羊、大尾寒羊及同羊的遗传关系较近,同 羊和哈萨克羊的关系很远。只是兰州大尾羊和蒙古羊的关系 很近有待进一步考证。其次是皮尔逊相关和明考夫斯基距离 法,二者结果大体相似,只是小尾寒羊和同羊之间换了个位 置;再其次是车贝雪夫距离,另外3种方法与历史渊源出入较 大,但并不能就此判断方法本身是否适宜。皮尔逊相关分析 的结果显示了大尾寒羊、兰州大尾羊及同羊的关系都比较近, 而且表明了同羊和小尾寒羊之间没有任何亲缘关系。需要注 意的是蒙古羊和大尾寒羊之间的关系很近尚需探讨。

3.3　聚类方法的判别　判断哪一种聚类方法所谓适宜与不适宜是根据考古和记载来进行衡量的,但每一个品种的形成 都不可避免地进行自然选择和人工选择以及品种间基因的交 流,所以同来源的不同品种间某些遗传特性可能是一致的,某 些遗传机制可能发生了变异,所以研究的方法不同和所选的DNA标记座位不同可能得出不同的结论。如王桂芝(2000)采 用了3个蛋白座位对山东4个地方绵羊品种进行了研究,结 果认为属于短脂尾型的洼地绵羊和长脂尾型的大尾寒羊的遗 传距离很近,属于一类[3]。杜立新,等(2001)用16个RAPD引物对4种绵羊的遗传距离分析认为小尾寒羊、大尾寒羊、洼地 羊、滩羊的亲缘关系较近,起源于共同的原始祖先(蒙古 羊)[2]。这与尾型和品种的起源之说有所不同。