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【主题词】 膀胱肿瘤; 尿激酶受体; 纤溶酶原激活
我们采用放射配基结合试验,研究人膀胱移行细胞癌细胞膜尿激酶受体(uPAR)的表达及与尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)的结合特性,探讨二者与膀胱移行细胞癌浸润及转移之间的关系。
一、材料与方法
1.标本收集:选择2000年12月~2001年5月间本院收治的膀胱移行细胞癌18例。G1期8例,G2期5例,G3期5例。Tis~T1 10例,T2~T4 8例。证实有盆腔淋巴结和(或)远处转移者6例,无转移12例。另取6例正常膀胱黏膜作对照,手术或活检标本获取后立即放入液氮,后置于-70℃冰箱保存。
2.细胞膜制备及uPA标记:按10 ml/g组织加预冷0.01mol/LHepes缓冲液,冰浴中匀浆,之后于4℃1700 r/min离心10 min,再以12000 r/min离心15 min, Hepes缓冲液洗沉淀1次,合并两次上清于44 000 r/min离心45 min,弃上清。膜沉淀用甘氨酸-HCI缓冲液于37℃酸化处理3 min,去除结合在uPAR上的内源性uPA,以便测定膜受体总容量。于44 000 r/min离心20 min, Hepes缓冲液洗沉淀2次后重悬,以BSA为标准,以Lowry法测定蛋白含量,根据结果调整膜蛋白浓度至2 g/L,于-20℃保存备用。采用标准氯胺-T法并稍加改进,标记uPA的放化纯度>95%,标记率>80%。
3.放射配基结合试验:取膜蛋白100μl与浓度分别为0.05、0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.20、2.00、4.00、8.00、12.00nmol/L的125I-uPA混合,加Hepes缓冲液至总容量为400μl,此为总结合管。非特异性结合管除上述成分外,尚含有终浓度大于标记配基100倍的未标记配基。各管在37℃反应30 min后立即置冰浴中,以44 000 r/min离心20 min,弃上清,预冷Hepes缓冲液洗沉淀3次,然后在γ计数仪上测定放射量。
4.统计分析:采用SAS软件。以标记配基的特异性结合(B)为自变量,特异结合同游离配基(F)之比(B/F)为因变量,进行直线回归,做Scatchard图,求出受体的最大结合容量Bmax和平衡解离常数Kd值,均数间的比较采用t检验。
二、结果
1.结合饱和实验:随着标记配基浓度的增高,膀胱癌组织125I-uPA与膜蛋白的结合逐渐增加,当反应体系中标记配基浓度达到2.0 nmol/L时,受体的特异结合趋于饱和。而正常膀胱黏膜的曲线饱和趋势不明显。在非特异结合试验中,当加入超过标记配基100倍的未标记配基时,膜蛋白上99%的标记配基被替代下来,而用Hank液的对照组仅有5%左右被替代。通过Scatchard公式处理并做图,求得膀胱癌组织uPAR的Bmax为(420.8±84.6) pmol/g蛋白,Kd值为(1.23±0.45) nmol/L。而正常膀胱黏膜的Bmax为(84.5±10.4)pmol/g蛋白,Kd值为(5.50±1.48) nmol/L。统计分析表明,肿瘤组织较正常膀胱黏膜Bmax值显著增高(P<0.01),Kd值却明显下降(P<0.01)。
2.膀胱移行细胞癌细胞膜uPAR结合特性与分级、分期和转移的关系:随着膀胱癌分级的增高Bmax逐渐增高(P<0.05),而Kd值逐渐下降(P<0.05)。浅表肿瘤的Bmax明显低于浸润肿瘤(P<0.01),而Kd值明显高于浸润肿瘤(P<0.05),转移组与无转移组相比,Bmax明显增高(P<0.01),Kd值明显降低(P<0.01)。
三、讨论
目前,有关纤溶酶原激活系统与膀胱肿瘤之间的关系报道尚少。有文献认为,泌尿路肿瘤有高水平的纤溶酶原激活剂,膀胱肿瘤浸出液中,uPA抗原水平的增高与膀胱肿瘤的分级分期有直接关系,uPAR的表达与膀胱肿瘤分级和分期的增高亦有相关性[1],并且uPA抗原水平的增高预示膀胱癌患者预后较差[2]。
Hudson等[3]在体外利用细胞培养技术进行研究,认为膀胱肿瘤细胞可产生uPA,表达uPAR,膀胱癌细胞在体外发生浸润需要uPA和uPAR的同时存在,但现在还未见有uPAR与uPA结合特性的研究报告。我们采用放射配基结合受体分析方法,首次检测了膀胱移行细胞癌细胞膜uPAR的结合位点[1]及其与uPA的亲和力。本研究表明,(1)随着标记配基浓度的增高,结合逐渐趋于平衡,即uPAR结合位点呈现可饱和性;(2)标记配基可被未标记的高浓度配基所替代,说明uPAR与uPA的结合呈可逆性。结果提示,随着膀胱肿瘤分级、分期的增高及转移的出现,uPAR的最大结合容量逐渐增加,即与uPA的结合位点随肿瘤恶性程度的增高而增多,同时平衡解离常数随之降低,即与uPA的亲和力增高。此结果与我们曾报道的免疫组化结果[1]相一致。
参考文献
1杨进益,李韶,周荣祥,等.尿激酶型纤溶酶原激活物及其受体在膀胱移行细胞癌中表达的临床意义.中华泌尿外科杂志,2000, 8: 465-466.
2 Foekens JA, Peters HA, Look MP, et al. The urokinase system ofplasminogen activation and prognosis in 2780 breast cancer patients.Cancer Res, 2000, 60: 636-643.
3 Hudson MA, McReynolds, LM. Urokinase and the urokinase receptor:association with in vitro invasiveness of human bladder cancer cell lines. Natl Cancer Inst,1997,89:709-717.
