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摘要：采用伪三元相图法探讨了复方丁香酚纳米乳的形成条件。所得制品外观澄明，平均粒径为(75.1±3.7)nm。通过二甲苯致小鼠耳肿胀试验、扭体试验和热板致痛试验，比较复方丁香酚纳米乳与普通混合液和清凉油的抗炎镇痛效果。结果表明，与普通混合液和清凉油相比，复方丁香酚纳米乳具有显著的抗炎镇痛作用。

关键词：伪三元相图；复方丁香酚纳米乳；抗炎；镇痛

纳米乳(nanoemulsion)是由水相、油相、表面活性剂和助表面活性剂组成的一种透明、粒径10～100nm、热力学及动力学稳定的各向同性体系。作为新型的药物载体，纳米乳具有增强药物的溶解性、提高生物利用度、促进药物透皮吸收、缓释、减轻不良反应等特点。

丁香酚(eugenol，1)为桃金娘科植物丁香[Syzygium aromaticum(L.) Merr. et Perry]挥发油中的主要成分。1有解热、镇痛、抗炎、抗氧化等药理活性，可杀菌止痒，且气味芳香，透皮吸收作用强[1]；桉叶油(2)和丹皮酚(3)均具有一定的抗菌消炎等作用[2]。这些药物挥发性强，有效作用时间短，因此药效并不理想。本试验以1、2、3等为主成分，采用伪三元相图法制备复方1纳米乳透皮制剂(已申请中国专利，申请号为200710306510.1)，考察其抗炎镇痛药效。

1 仪器与试药

JEM1230型透射电子显微镜(日本日立)；Nicomp388/ZetaPALS型激光粒度测定仪(英国马尔文公司)；UV-2102型紫外分光光度计(尤尼柯仪器有限公司)。

1(纯度99.9％，批号200703128)、香茅油(4)(纯度95％，批号200703349)(江西省吉安市恒诚天然香料油提炼厂)；2(纯度99％，批号200703362)、3(纯度99.9％，批号200703205)、薄荷油(5)(纯度98％，批号200703251)、樟脑(6)(纯度98％，批号200703184)(江西省吉水县水南威霸药用油提炼厂)；聚氧乙烯醚氢化蓖麻油(RH40BASF公司)；吐温-80、肉豆蔻酸异丙酯(IPM)(杭州高绮香精公司)；清凉油(上海中华制药厂，批号070537)；冰醋酸、二甲苯、无水乙醇均为分析纯。

昆明种小鼠，雌雄各半，18～22g(第四军医大学实验动物中心)。

2 方法与结果

2.1 复方1纳米乳的制备

2.1.1 伪三元相图的绘制

精密称取1 0.8g、2 0.6g、4 0.2g和5 0.4g，混匀作为混合油相。将表面活性剂RH40或吐温-80与助表面活性剂无水乙醇(含3 0.4g和6 0.3g)分别按3∶1、5∶1和7∶1的比例(Km)混匀作为混合表面活性剂，再分别与混合油相按9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、3∶7、2∶8和1∶9的比例(w/w)混匀，25℃搅拌滴加蒸馏水，观察体系由浊至清的现象，记录临界点时的各组分百分比。Km为7∶1时两种体系的伪三元相图见图1。

试验表明，随Km值的升高，纳米乳区面积增大，当达到7∶1时，所形成的纳米乳区面积最大，因此Km选择为7∶1。此时，混合表面活性剂与混合油相比例为9∶1、8∶2和7∶3时可形成纳米乳，其余比例均不能形成纳米乳。

2.1.2 复方1纳米乳的稳定性研究[3]

取Km为7∶1时制得的复方1纳米乳，分别于-20℃、室温和50℃环境放置24h，观察其外观、黏度、色泽及均匀性变化。离心(655×g)30min观察有无破乳分层现象。结果表明，若以RH40为表面活性剂，混合表面活性剂与混合油相比例为9∶1和8∶2时形成的复方1纳米乳较稳定，3种条件放置24h均呈透明均一状态，离心也未见分层，但比例为7∶3时制得的复方1纳米乳于50℃放置24h会有絮状物析出。以吐温-80为表面活性剂，混合表面活性剂与油相比例为9∶1和8∶2时所得复方1纳米乳离心后均分层；于-20和50℃放置24h则出现混浊。故宜选用RH40为表面活性剂。

2.1.3 复方1纳米乳的含量测定

以1作为含量测定的指标性成分，采用UV法测定复方1纳米乳(Km为7∶1，混合表面活性剂与油相比例为9∶1或8∶2)和清凉油中1的含量[4]。

1对照液：精密量取1 0.25g，置50ml量瓶中，用无水乙醇定容，精密量取溶液10ml置50ml量瓶中，用蒸馏水定容得浓度1mg/ml的溶液。

复方1纳米乳供试液：精密量取复方1纳米乳0.25g，置50ml量瓶中，用无水乙醇定容，精密量取溶液10ml置50ml量瓶中，用蒸馏水定容。同法制备空白纳米乳使用液。

清凉油供试液：精密称取清凉油0.25g，置50ml量瓶中，加无水乙醇定容，50℃水浴加热溶解，摇匀，离心(50×g)10min，精密量取上清液10ml置50ml量瓶中，用蒸馏水定容。

分别精密量取上述溶液0.5ml，各置50ml量瓶中用蒸馏水定容。以蒸馏水为参比，在200～4 0 0 n m波长范围内进行紫外扫描。结果表明，1在280nm处有最大吸收，其它物质在此波长处不干扰吸收，因此确定1的检测波长为280nm。精密量取1对照液0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4 m l，各置5 0 m l量瓶中用蒸馏水定容，分别于2 8 0 n m波长处测定吸光度(D)，以浓度(c)对D线性回归，得标准曲线方程D=0.0152c+0.0034，r=0.9999。表明1浓度在10～80μg/ml范围内线性关系良好。

分别精密量取复方1纳米乳供试液和清凉油1、1.5、2、2.5、3ml，各置50ml量瓶中用蒸馏水定容，于280nm波长处测定吸光度，由回归方程计算浓度。平行试验5次。结果表明，比例为9∶1和8∶2时形成的复方1纳米乳中1的含量分别为(1.2±0.3)％和(3.2±0.4)％；清凉油中1的含量为(1.5±0.4)％。比例为8∶2时1的含量较高，因此复方1纳米乳的最佳配方选为：以RH40为表面活性剂，无水乙醇为助表面活性剂，Km为7∶1，混合表面活性剂与混合油相比例为8∶2。

测得按优化处方制备的复方1纳米乳平均粒径为(75.1±3.7)nm(n=3)。透射电镜结果显示，纳米乳呈球形，形态均匀，见图2。

2.2 复方1纳米乳的抗炎作用

2.2.1 试验设计选取健康小鼠30只，随机分为5组，即空白对照组、阳性对照组、空白纳米乳(油相用IPM替代，其余参数同优化处方)组、普通混合液(将处方量3、6溶于无水乙醇中，再与处方量1、2、4和5混匀)组、复方1纳米乳组，每组6只，雌雄各半。空白对照组给予适量生理盐水；阳性对照组给予0.2g/cm2的清凉油(1含量约3mg)；空白纳米乳剂量0.1ml/cm2；普通混合液和复方1纳米乳剂量0.094ml/cm2(1含量约3mg)。

2.2.2 二甲苯致小鼠耳肿胀模型[5]将各组药物分别均匀涂于小鼠左右耳前后两面，1h给药一次，连续给药8h。以二甲苯为致炎剂，末次给药1h后，将小鼠用乙醚麻醉，在每只小鼠右耳的前后两面涂布致炎剂0.02ml，左耳作对照。15min后处死小鼠，剪下双耳用9mm直径打孔器分别在同一部位打下圆耳片，称重，以两耳片的重量差异为肿胀度，计算肿胀抑制率[抑制率(％)=(空白对照组肿胀度－实验组肿胀度)／空白对照组肿胀度×100％]。采用SPSS11.0分析软件统计分析，结果见表1。