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雪莲是国家三级保护植物,是西藏、新疆、青海等西部高原寒带地区的常用民族药和民间药,在防治心脑血管疾病,治疗风湿性疼痛、抗癌等方面开发利用潜力很大。然而其生长环境特异,资源有限,价格昂贵,所以,雪莲细胞培育物高产黄酮细胞系的筛选成功,无疑为进一步开发、利用这一有价值的药用资源奠定了基础。目前对野生雪莲的药理研究发现,其有效成分黄酮类化合物和多糖等有明显的活性和治疗作用,其药理作用主要有抗炎镇痛、强心、终止妊娠、抗癌作用,清除自由基及抗疲劳作用,解痉、降压和平喘作用等。因此,我们对野生、培养雪莲总黄酮的镇痛、抗炎以及免疫调节作用进行比较研究,以期为进一步推广这一新型培育方法提供理论指导,为开发有我国自主产权的新药奠定基础。
实验材料动物昆明种小鼠,雄性,体重 18~22 g;Wistar 大鼠,雌雄各半,体重 180~220 g;BALB/C 小鼠,雄性,体重 18~20 g,均购自北京维通利华实验动物技术有限公司[合格证号:京2002-0003]。
药物与试剂野生水母雪莲(Saussurea medusa Maxim)总黄酮(纯度、培养雪莲总黄酮(水母雪莲红色系固体培养细胞)的碱洗部分(纯度 82%)由中国科学院植物所提供;安痛定注射液每 2 mL中含 0.1 g氨基比林、0.04 g安替比林、0.018 g巴比妥)由天津华津制药厂提供(批号 960807);氢化可的松,上海第九制药厂(批号 981002);角叉菜胶,Sigma公司(批号; 环 磷 酰 胺 ,上 海 华 联 制 药 有 限 公 司 (批 号;ConA、LPS(脂多糖)、RPMI1640 培养基均为美国公司产品;小牛血清为美国Hyclone公司产品;由中国科学院原子能研究院提供;96 孔培养板为美国公司产品。
仪器电热 恒温 水浴箱,北京 市医疗设备 总厂;电子 天平,LIBROR EB-280M-22,日本岛津仪器公司;XDS-1B倒置生物显微镜,重庆光电仪器总公司;LS-9800 液体闪烁计数仪,美国BECKMAN公司产品;Titertek Cell Harvester 550 多头细胞收集器,英国产。培养箱,日本产。
方法与结果热刺激小鼠甩尾法小鼠 80 只,随机分为对照组(生理盐水)、野生、培养雪莲总黄酮高、中、低剂量组(40、20、10 mg/kg),其中阳性基金项目:国家自然科学基金资助项目通讯作者:周钟鸣,Tel:010-64046469,E-mail:
药安痛定组(10 mL/kg)为腹腔给药,其余均口服。给药前先用秒表测定各小鼠自尾尖浸入 50 ℃温水中至尾部甩起的潜伏期作为痛阈,单次给药后 0.5、1、2、4 h 再分别测定甩尾潜伏期,计算镇痛率,进行组间 t 检验。结果见表 1。
镇痛率=(给药后潜伏期-给药前潜伏期)/给药前潜伏期×表 1 两种雪莲总黄酮对小鼠热刺激甩尾的影响—±镇痛率组别对照组 -16.50±25.5 -1.54±21.5 -2.02±14.5 -4.59±安痛定组 71.40±±±±培养雪莲组 38.90±±±±±±±±±89.3 40.40±±52.5 12.40±野生雪莲组 40.00±±±±±±±±±±±±注:与对照组比较,*P <0.05,**P <0.01(下同巴豆油小鼠耳廓肿胀法小鼠 80 只,随机分为对照组(生理盐水)、野生、培养雪莲(醇洗、碱洗)高、中剂量组(50、25 mg/kg)和阳性药氢化可的松组(25 mg/kg),其中除阳性药为腹腔给药外,其余均口服,连续给药 3 d(每天 1 次),末次给药 1 h 后,在左侧耳廓涂抹 2%巴豆油(巴豆油、乙醇、乙醚的比例为 0.2∶2∶μL/只,4 h 后处死,用直径 8 mm 的不锈钢铳铳下左右耳廓,称重,计算耳肿胀率,进行组间 t 检验。结果见表 2。
耳肿胀率=(左耳重-右耳重)/右耳重×表 2 两种雪莲总黄酮不同提取部分对小鼠耳廓肿胀的影响—±组别 剂量(mg/kg) 肿胀率对照组 24.7±氢化可的松组 25 4.9±培养雪莲醇洗组 25 18.0±±培养雪莲碱洗组 25 17.5±±野生雪莲醇洗组 25 19.2±±野生雪莲碱洗组 25 19.2±±角叉菜胶致大鼠足肿胀法大鼠 80 只,随机分为对照组(生理盐水)、野生、培养雪莲(碱洗)高、中、低剂量组(40、20、10 mg/kg)和阳性药氢化可的松组(25 mg/kg),除阳性药为腹腔给药外,其余均口服连续给药 3 d(每天 1 次),末次给药 1 h 后,在其右后肢足跖·34·部皮下注射 1%角叉菜胶 100 μL,于注射后 4 h 用千分尺测量肿胀足跖部厚度,计算足肿胀率,进行组间 t 检验。结果见表。
足肿胀率=(注射后足跖厚度-注射前足跖厚度)/注射前足跖厚度×表 3 两种雪莲总黄酮不同提取部分对大鼠角叉菜胶足肿胀的影响—±组别 剂量(mg/kg) 肿胀率对照组 34.38±氢化可的松组 25 15.35±培养雪莲碱洗组 40 19.58±±±野生雪莲碱洗组 40 17.26±±±小鼠脾脏B淋巴细胞转化实验雄性BALB/C小鼠,摘眼球放血处死,无菌条件下摘取脾脏用含 10%小牛血清 1640 培养液,按 15 mg脾重/mL制成脾细胞悬液(5×过 200 目钢丝网,放冰浴中待用。精密称取用 1640 液配成 1000 μg/mL。取 96 孔平底培养板,分对照组、野生、培养雪莲(醇洗、碱洗)高、中、低剂量组(100、、1 μg/mL)和阳性药环磷酰胺组(30 μg/mL),每组 4 孔,每孔加入脾细胞悬液 100 μL,LPS 10 μL,再加入 10%小牛血清培养液,使每孔终体积为 200 μL,摇匀,置 37 ℃、培养箱培养 72 h,终止培养前 24 h,每孔加入×μL,培养完毕,用多头细胞收集器收集细胞于 49 号玻璃纤维滤膜上,并依次用蒸馏水、5%三氯乙酸、无水乙醇抽滤滤膜置闪烁瓶中,用液体闪烁计数仪测定掺入的放射强度值。结果见表 4。
表 4 两种雪莲总黄酮不同提取部分对小鼠脾B淋巴细胞转化的影响—±组别 剂量(μg/mL) cpm 抑制百分率对照组 8235.5±环磷酰胺组 30 5616.0±培养雪莲醇洗组 100 1834.0±±±培养雪莲碱洗组 100 3887.5±±±野生雪莲醇洗组 100 800.8±±±野生雪莲碱洗组 100 1446.8±±±小鼠脾脏T淋巴细胞转化实验雄性BALB/C小鼠,摘眼球放血处死,无菌条件下摘取脾脏用含 10%小牛血清 1640 培养液,按 15 mg脾重/mL制成脾细胞悬液(5×过 200 目钢丝网,放冰浴中待用。精密称取用 1640 液配成 100 μg/mL备用。取 96 孔平底培养板分对照组、野生、培养雪莲(醇洗、碱洗)高、中、低剂量组、10、1 μg/mL)和阳性药环磷酰胺组(30 μg/mL),每组孔,每孔加入脾细胞悬液 100 μL,ConA 20 μL,再加入 10%小牛血清 1640 培养液,使每孔终体积为 200 μL,摇匀,置 37 ℃、培养箱培养 72 h,终止培养前 24 h,每孔加入-×μL,培养完毕,用多头细胞收集器收集细胞于号玻璃纤维滤膜上,并依次用蒸馏水、5%三氯乙酸、无水乙醇抽滤,滤膜置闪烁瓶中,用液体闪烁计数仪测定掺入的放射强度cpm值。
表 5 两种雪莲总黄酮不同提取部分对小鼠脾T淋巴细胞转化的影响—±组别 剂量(μg/mL) cpm 抑制百分率对照组 253341.0±环磷酰胺组 30 140848.5±培养雪莲醇洗组 100 88309.3±±±培养雪莲碱洗组 100 129940.8±±±野生雪莲醇洗组 100 7715.8±±±野生雪莲碱洗组 100 50354.5±±±讨论通过对野生、培养雪莲总黄酮的比较研究发现,二者都具有镇痛、抗炎和免疫抑制作用。野生和培养雪莲总黄酮高、中、低 3 个剂量对小鼠热刺激甩尾潜伏期都有明显的延长作用,作用与安痛定大致相当,作用时间可达 4 h以上,二者没有显著性差异。野生、培养雪莲总黄酮均能明显抑制巴豆油所致炎性肿胀。有文献报道,黄酮对大鼠蛋清性关节炎急性炎症有明显的对抗作用和镇痛作用,其抗炎作用主要是通过促进肾上腺皮质激素合成增加而产生的。另有报道,由角叉菜胶大鼠足跖引起的实验型炎症,第1小时由组胺和5-HT介导,直到第 2.5 小时由激肽维持,2.5 h后则由PGs介导。我们的实验结果表明,两种雪莲总黄酮均能明显抑制角叉菜胶所致大鼠足跖肿胀,故推测其抗炎机理可能与抑制PGs分泌有关,并且能产生肾上腺皮质激素样作用。野生、培养雪莲总黄酮对小鼠T、B淋巴细胞转化功能都有明显抑制作用,说明其对体液免疫以及细胞免疫都有抑制作用。2006 年 1 月第 13 卷第 1 期 中国中医药信息杂志 ·35·当归四逆加吴茱萸生姜汤和北细辛对小鼠肾脏组织细胞、酶的影响邓 毅王 昕张艳萍姚 凝杨志军甘肃中医学院,甘肃 兰州 730000;2.甘肃中医学院附属医院,甘肃 兰州摘要:目的 观察当归四逆加吴茱萸生姜汤(原方)、原方去木通和北细辛对肾脏毒性的作用。方法 将小鼠随机分为 4 组,各组分别以生理盐水及药物灌胃,每日 1 次,连续给药 21 d。检测各组对小鼠肾脏组织细胞含量、酶活性的影响。结果 当归四逆加吴茱萸生姜汤等药物组对组织细胞、酶等指标均有影响,具有统计学意义(P<0.05)。结论 当归四逆加吴茱萸生姜汤(原方)组、原方去木通组、北细辛组对肾脏均产生毒性。