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二氢乳清酸脱氢酶(Dihydroorotate dehydrogenase, DHODH)是一种含铁的黄素依赖的线粒体酶,是核酸中嘧啶合成的关键酶,催化嘧啶从头生物合成途径中的第四步反应[1]. DHODH是免疫相关疾病的重要靶点,抑制DHODH,可以阻断新生嘧啶合成,致使DNA合成障碍,抑制活化的T淋巴细胞、B淋巴细胞以及肿瘤细胞的增殖,从而在免疫抑制和抗肿瘤中起重要作用.
DHODH抑制剂来氟米特已经成功应用于自身免疫性疾病如红斑狼疮、类风湿性关节炎和肾病综合征等临床治疗.而另一个抑制剂布喹那已经分别完成了抗肿瘤和器官移植免疫抑制的Ⅱ期临床实验.布喹那的临床试验研究结果发现,布喹那联合环孢霉素A或顺铂口服给药时,可引起粘膜炎、白血球减少及血小板减少[2~4];而来氟米特的长期使用也会产生较大的毒副作用,如腹泻、肝酶异常、皮疹或高血压等[5~9].因此寻找新型高效、副作用小的DHODH抑制剂就成为免疫相关疾病及肿瘤治疗中的研究热点.
药物呈现药理作用是与体内生物大分子发生结合作用的结果,药物分子以特定的三维结构与受体的结合部位相结合,在三维空间中所采取的特定构象是呈现药理活性的必要前提,从药物分子的三维特征把握药物与受体的作用,是药物分子设计和构效关系研究中常用的策略.药效团模型方法是计算机辅助药物设计中基于配体的一种药物设计方法,可最大限度地利用已有化合物的三维结构信息发现新药物[10~12].目前药效团模型方法已被广泛应用于药物分子的虚拟筛选及构效关系研究[13~18].
本文以布喹那和来氟米特两个化合物为先导物,经过结构设计和实验验证,结合已有系列具有DHODH抑制活性的化合物报道[19, 20],进行了构效关系研究,构建表征受体配体相互作用的药效团模型,用于数据库搜索,定量计算未知活性化合物的活性值,指导药物设计及结构优化,以期能够发现具有潜在活性的化合物.
1 实验部分
1.1 药效团模型药效团模型构建采用美国Accelrys公司的Catalyst软件包(版本),主要模块包括Catalyst/VISUALIZER(分子构建、三维结构编辑、三维结构搜索), ConFirm(多构象模型生成工具), Catalyst/COMPARE(分子和药效团叠合), HypoGen(构建药效团模型)和CatScramble(评价药效团模型).除特殊说明外,所有参数均为系统默认值.
1.2 实验过程
1. 2. 1 训练集化合物构象分析 由文献[19, 20]报道的31个化合物组成训练集,其半数抑制浓度(IC50)范围为7~63000 nmol/L(表1).各化合物化学结构式见图1.对所选化合物优化至局部最小能量,利用Bestquality conformergeneration模块,以能量间隔83·74 kJ/mol为步长,计算所有训练集化合物的多个构象.
1. 2. 2 药效团特征的提取 Catalyst系统定义的药效特征可表征药物与受体结合所发生的静电、氢键和疏水相互作用,主要有氢键受体(Hydrogen bond acceptor, A)、氢键供体(Hydrogen bond donor, D)、:基于药效团模型的DHODH抑制剂构效关系研究Fig. 1 M olecular structures ofDHODH inhibitors constituting the training set疏水基团(Hydrophobic region, Y)、负电荷基团(Negative charge, NC)、负电离子化基团(Negativeionizable, NI)、正电荷基团(Positive charge, PC)、正电离子化基团(Positive ionizable, PI)和芳香环(Ring aromatic, R).药效团模型中除包含药效特征元素之外,还包括特征元素之间的距离、角度和二面角来定义的空间约束,其中距离限制是最为常见的约束形式.
1.2. 3 药效团模型的计算与评判 通过对已知三维结构和生物活性数据的训练集化合物的多个构象进行叠合, Catalyst/HypoGen抽象出训练集化合物所共有的药效团特征及三维空间限制,计算所得药效团模型可能含有的药效团特征和数目,生成药效团模型来描述化合物生物活性的共有特性,所建立的药效团模型可用来计算活性未知化合物的活性值,也可作为提问结构,结合数据库搜索技术筛选具有潜在活性的化合物.
HypoGen算法计算药效团模型的计算过程包括Constructive phase, Subtractive phase, Optimizationphase 3个步骤.通过Constructive phase步骤识别出可表达活性化合物共有药效特征的模型,再经过Subtractive phase排除表达了无活性化合物共有特征的模型,最后经Optimization phase进一步优化初始模型,得到得分最高的模型[21].
利用Catalyst计算药效团前,需要提供最多5个候选药效特征.通过考察不同候选药效团特征对结果的影响,结合Catalyst系统提供的评价方法筛选出较优药效团模型. Catalyst利用费用函数(Costfunction)评价药效团模型,每个模型都可用此函数表达模型的复杂性、化学特征与理想权重的偏差以及预测活性与活性实验数据的误差,每个模型均有自己的Total cost值.计算结果给出2个理想化模型,其中1个是最好的模型,即活性值相关曲线的斜率为1,其cost值为Fixed cost值; 1个是最差模型,即活性值相关曲线的斜率为0,其cost值为Null cost值.根据Occam′s razor原理,认为最优药效团的Total cost值最小,且应接近Fixed cost值,小于Null cost值. Configuration cost是另一个重要的参数,由模型的空间复杂程度决定,较优模型的Configuration cost值应不大于17[22].
应用CatScramble模块评价药效团:基于Fishermethod随机交叉验证,把训练集分子结构与活性打乱重新计算,检验模型对化合物活性的计算值与实际值是否具有很强的相关性,较优药效团模型的相关系数应比重新计算后模型的相关系数大, Total cost值应比重新计算后模型的Total cost值小.
1. 2. 4 基于药效团的数据库搜索 利用Catalyst系统中的FastFlexible Database Search模式进行基于药效团的三维数据库搜索,将药效团模型与数据库中化合物的多个构象一一进行匹配,寻找能够与药效团匹配的化合物;对搜索结果命中的化合物采用Best fit/compare模式进行化合物多构象与药效团匹配,根据匹配程度预测化合物活性.
2 结果与讨论
2.1 DHODH抑制剂药效团模型根据训练集各化合物所含药效团特征,针对不同的药效团特征组合,计算药效团模型. Catalyst系统特征设置数最大为5,选择不同的药效特征组合,计算结果见表2.得到8个含有不同特征、相关系数较高的模型,相关系数在0·8395~0·8922之间. 8个模型与已知DHODH作用的配体化合物A771726匹配结果示意图见图2.
药效团模型反映了配体DHODH抑制剂与靶点DHODH作用时,可能发生的氢键相互作用、疏水相互作用和π-π相互作用.已报道复合物(PDBID∶1D3H)中DHODH与A771726结合模式见图3,显示A771726结构中连在双键上的羟基与DHODH活性口袋中的酪氨酸残基Tyr356存在氢键相互作用.药效团计算所得8个模型与A771726匹配结果显示,除模型H1以外其它7个模型中氢键受体或氢键给体特征均与A771726结构中连在双键上的羟基匹配,因此可认为所得到的7个模型可反映受体配体相互作用的关键特征,可用于计算化合物活性和数据库搜索发现具有潜在活性的化合物.
