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[摘要]　目的　通过观察组蛋白去乙酰化酶11(histone deacetylase 11,HDAC11)及IL-10表达水平在3种大鼠肝移植模型中的变化,探讨肝移植免疫耐受形成的相关机制。方法　纯系Lewis和BN大鼠各30只,建立肝移植排斥模型后将受体分为排斥组(Lewis-BN)、免疫抑制剂干预组(Lewis-BN)、耐受组(BN-lewis),每组10只。干预组于术后1~7 d以1 mg/kg肌肉注射他克莫司(FK506);分别于术后7 d处死受体。移植物排斥反应程度采用Banff评分标准;免疫荧光组织化学观察HDAC11表达情况;实时荧光定量PCR及Western blot测定肝组织HDAC11 mRNA和蛋白表达水平;酶联免疫吸附法检测血清IL-10及IFN-γ的含量。结果　术后7 d,排斥组为严重的急性排斥反应, Banff评分Ⅲ级,干预组为Ⅱ级,耐受组为0~I级。排斥组HDAC11 mRNA及蛋白表达的水平明显高于干预组和耐受组(P<0·05),耐受组表达量最低,与干预组有统计学差异(P<0·05)。排斥组IL-10表达明显低于干预组和耐受组(P<0·05);而IFN-γ含量排斥组明显高于干预组和耐受组(P<0·05)。结论　HDAC11通过对IL-10的调控促进或抑制肝移植免疫耐受的形成。

[关键词]　组蛋白去乙酰化酶11;肝移植;免疫耐受;大鼠

同种异体肝移植是目前治疗终末期肝脏疾病的有效手段,但移植后产生的排斥反应严重影响着患者的生存时间。自1989年他克莫司(FK506)首次用于肝移植以来,在临床上已广泛应用于各种急性排斥反应。

肝移植是临床应用FK506最主要的适应证,其作用机制与环孢素A(CsA)相似,都是通过抑制相关多细胞因子的产生和表达来抑制T细胞的活化[1]。然而,为了避免长期使用免疫抑制剂,诱导移植术后免疫耐受才是最佳途径。但如何减轻免疫排斥反应,诱导免疫耐受仍是肝移植领域的一大难题。最新研究[2]发现,组蛋白去乙酰化酶11(histone deacetylases11, HDAC11)是调节APC细胞IL-10转录的关键因子, IL-10通过维持T细胞对自身的免疫耐受产生强大的免疫抑制作用。本研究通过建立大鼠肝移植急性排斥、耐受模型及应用免疫抑制剂处理急性排斥反应后,观察HDAC11及其下游因子IL-10的变化,试图证明HDAC11在大鼠肝移植免疫耐受产生中的重要作用,以期为临床移植免疫耐受的诱导提供相应的靶点。

1　材料与方法

1. 1　实验动物纯系雄性6周龄Lewis(Rtll)大鼠30只和7~8周龄BN(Rtln)大鼠30只,体质量150~180 g,购于北京维通利华实验动物有限公司。上述动物饲养于重庆医科大学实验动物中心无菌实验室。供、受体术前8 h禁食,不禁水,受体术后不禁食,水。

1. 2　主要试剂

FK506购于美国Sigma公司;总RNA提取试剂盒自美国Promega公司;兔抗鼠HDAC11多克隆抗体购自美国Imgenex公司; IL-10、IFN-γELISA测定试剂盒购自美国Activemotif公司。

1. 3　大鼠

原位肝移植模型的建立及分组纯系Lewis和BN大鼠(各30只)建立肝移植排斥模型后,分为排斥组(Lewis-BN)、免疫抑制剂干预组(Lewis-BN)、耐受组(BN-lewis)。排斥组和干预组受体为BN大鼠,耐受组受体为Lewis大鼠,每组10只。干预组将5 mgFK506溶于50 ml生理盐水,术后1~7 d以1 mg/kg肌肉注射[3]。参照Peng等[4]介绍的改良Kamada袖套法,建立大鼠原位肝移植动物模型。于术后第7天处死受体,抽取下腔静脉血液5 ml并切取肝左外叶组织备检。

1. 4　肝脏组织

病理观察取左肝前叶肝组织放人10%中性甲醛中固定24~48 h,常规脱水、透明、石蜡包埋、5μm厚切片,HE染色,光学显微镜观察;根据Banff等制定的急性排斥反应标准进行病理分级。

1. 5　肝脏组织

HDAC11荧光定量分析肝组织石蜡切片常规脱蜡,水化,磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗。0. 4%胃蛋白酶盐酸溶液37℃抗原修复30 min, PBS冲洗5 min×3次。10%正常山羊血清封闭,室温孵育30 min。滴加混合好的兔抗鼠一抗(最终稀释浓度为1∶100), 4℃过夜。PBS冲洗, 5 min×3次。滴加混合好的异硫氰酸荧光素(FITC)标记的羊抗兔二抗(最终稀释浓度为1∶100),室温反应2 h, PBS冲洗5 min×3次, 90%甘油封片。以Zeiss510 LSM激光共聚焦显微镜检测HDAC11的荧光定量表达。以绿色荧光通道扫描观察。绿光的激发波长为488 nm,在530 nm波长以上观察。每张切片选取荧光表达最强的10个视野观察并由计算机扫描软件测定荧光强度与面积。HDAC11的荧光值=平均荧光强度×平均荧光面积。

1. 6　肝组织

HDAC11 mRNA及蛋白表达水平检测Real-time PCR测定各组肝脏HDAC11 mRNA表达水平。按Trizol试剂盒说明书提取肝脏组织总RNA。HDAC11上游引物5′-GTTTACAACCGCCACATCTACC-3′,下游引物5′-AAC-CACTTCATCCCTCTTCACA-3′,扩增产物为249 bp;内参照β-ac-tin上游引物5′-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3′,下游引物5′-TTTAATGTCACGCACGATTTC-3′,扩增产物为150 bp;反转录后行实时荧光定量PCR。mRNA相对表达量: 2-△CT×100%。△CT=目标基因CT值-内参CT值。Western blot测定各组HDAC11蛋白表达水平。Western blot产物电泳条带,采用美国Bio-Rad公司Quantity 4. 0图像分析软件行扫描分析。

1. 7　血清IL-10和IFN-γ含量检测根据ELISA试剂盒说明,测定各时段血清IL-10含量。

1. 8　统计学分析数据

以-x±s表示,组间比较采用统计学软件SPSS 17. 0进行单因素方差分析。

2　结果

2. 1　病理组织学观察排斥组术后7 d肝脏病理表现为汇管区大量淋巴细胞浸润,并累及胆管、血管,肝小叶结构消失,伴有局灶性的出血、坏死;Banff评分Ⅲ级。干预组表现为中等量的淋巴细胞浸润,肝血窦压缩,淤血;Banff评分Ⅱ级。耐受组汇管区为少至中等量淋巴细胞浸润,胆管、血管未受侵犯;Banff评分I~Ⅱ级(图1)。

2. 2　肝脏组织HDAC11荧光表达情况术后7 dHDAC11在排斥组、干预组和耐受组中荧光值分别为34.25±3.57、12. 52±1. 68、4. 95±0. 83。排斥组明显高于干预组和耐受组(P<0.05),干预组高于耐受组(P<0.05)。

2. 3　不同移植模型处理对HDAC11 mRNA及蛋白表达水平影响术后第7天,排斥组、干预组和耐受组HDAC11 mRNA和蛋白相对含量(图2)分别为0. 91±0. 12、0. 52±0. 07、0. 24±0. 02和1·76±0. 21、0. 93±0. 13、0. 22±0. 02。耐受组mRNA及蛋白表达水平明显低于干预组和排斥组(P<0·05);排斥组表达量最高,且高于干预组(P<0·05)。