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摘　要:目的探讨不同相对分子质量(Mr)及不同工艺方法获得的山羊羊胎免疫调节因子(GEIF)生物活性效果。方法运用Ea玫瑰花环试验和T淋巴细胞转化试验进行对比分析。结果超滤法提取GEIF,不同Mr(3 000、5 000和10 000) Ea玫瑰花环恢复率和T淋巴细胞转化率之间没有明显差异;超滤法提取GEIF,Ea玫瑰花环恢复率和T淋巴细胞转化率均高于透析法。结论采用超滤法提取GEIF生物活性优于透析法,不同Mr提取GEIF生物活性无明显差异。

关键词:山羊羊胎免疫调节因子; Ea玫瑰花环; T淋巴细胞转化;生物活性

文献证明人胎盘免疫调节因子(placenta im-mune-regulating, PIF)具有免疫调节作用和临床治疗效果,主要针对恶性肿瘤、病毒性肝炎以及机体免疫力低下人群或免疫失调疾病[1]。在国外,瑞士已经运用绵羊羊胎盘提取液生产出了美容、养颜、抗衰老的化妆品。目前对山羊羊胎免疫调节因子(GEIF)的免疫活性研究在国内外还未见报道。本文运用胎盘提取工艺对GEIF理化性质及生物活性进行了研究[2]。运用Ea玫瑰花环试验和T淋巴细胞转化试验方法对比分析不同相对分子质量(Mr)及不同工艺方法获得的GEIF生物活性,以探讨它们之间的生物活性是否存在差异,明确不同Mr及不同工艺方法获得的GEIF生物活性效果。

1　材料与方法

1.1　试　剂

RPMI 1640培养液, CIBCO公司,批号:20020608; PHA,上海伊华生物公司,批号:20020301;小牛血清,兰州生物制品研究所,批号:20020309;淋巴细胞分离液,上海恒信化学试剂有限公司,批号:20021103;25%戊二醛溶液,上海化学试剂采购供应站试剂厂,批号:200020908;肝素抗凝全血,西南医院输血科;绵羊全血,第三军医大学实验动物中心。

1.2　仪　器

Himac-CR21G型高速离心机,日本;Hereaeus型CO2培养箱,德国;Millipore超滤器,Millipore公司。

1.3　GEIF的制备用透析法[3]、超滤法[4]制备,作为GEIF供试品。

1.4　T淋巴细胞转化试验无菌取健康人肝素抗凝全血5 ml,待用;取GEIF 1.0 ml加等量RPMI 1640培养液稀释与PHA和空白(生理盐水)形成对照;分别加全血0.2 ml,37℃、72 h,CO2培养箱培养。培养完毕,离心5 min(1 500r/min);弃上清,每管加0.075 mol/L KCl溶液5 ml,混匀,37℃水浴15min;加入固定液1.0 ml预固定,边加边振摇,置室温15 min,离心15 min(2 000r/min);弃上清,加入固定液5 ml,边加边振摇,置室温30 min,离心,弃上清,加入固定液5 ml,边加边振摇,置室温20 min,离心。制片染色。结果以转化百分率计算。

转化率=转化细胞数/(转化细胞数+未转化细胞数)×100%1.5　Ea玫瑰花环试验1.5.1　淋巴细胞悬液的制备　取健康人肝素抗凝全血4 ml,用淋巴细胞分离液分离淋巴细胞,将所获淋巴细胞用Hanks液洗3次,将细胞用RPMI 1640培养液制成5×106/ml。

1.5.2　脱受体的制备　将细胞悬液大部分作脱受体,即45℃,30 min,余下少许作脱受体前对照用。

1.5.3　0.5%羊红血球的制备　颈静脉取肝素抗凝绵羊全血5 ml,用Hanks液洗3次,最后1次制压积红血球,用RPMI 1640培养液稀释成0.5%备用。

1.5.4　反应　取GEIF 1.0 ml,加RPMI 1640培养液1.0 ml稀释。与脱受体前和脱受体后形成对照;加入5×106/ml淋巴细胞悬液0.025 ml,混匀,37℃,水浴90 min。加入0.5%羊红血球0.03 ml混匀,37℃,水浴5 min。低速离心5 min,冰浴15 min,取上清0.06 ml,加0.8%戊二醛0.025 ml置冰浴1~2 min,再轻吹打5次,冰浴15 min。制片,姬姆萨染色液染色;结果判定:在高倍镜下或油镜下数至少400个细胞,每个淋巴细胞结合3个以上的绵羊红细胞为玫瑰花结形成细胞,形成玫瑰花结的淋巴细胞数以百分率表示。

1.6　统计学处理采用SPSS11.0统计软件包对所有数据进行单因素方差分析和两两组间One-Way ANOVAt检验,实验数据以x±s表示。

2　结　果

2.1　不同MrGEIF Ea玫瑰花环恢复率比较用Ea玫瑰花环恢复率检测不同Mr(3 000、5 000、10 000)GEIF生物活性时发现,不同MrGEIF实验组与其相对应的脱受体组比较均有明显差异(P<0.01);脱受体组与脱受体前组比较差异极其显著(P<0.001);Mr3 000、5 000和10 000实验组之间没有明显的差异(P>0.05),见表1。

2.2　不同MrGEIFT淋巴细胞转化率比较用T淋巴细胞转化率检测Mr3 000、5000、10 000的GEIF生物活性时,同样发现,不同实验组与其相对应的空白组(生理盐水)比较均有显著差异(P<0.001);有丝分裂原PHA组与空白组比较差异极显著(P<0.001);Mr3 000、5 000和10 000,3个实验组之间却没有明显差异(P>0.05),见表2。

2.3　超滤法与透析法GEIF Ea玫瑰花环恢复率比较本实验对超滤法和透析法生产出的同一Mr的GEIF Ea玫瑰花环恢复率检测时观察到,将制备好的淋巴细胞悬液45℃、30 min脱受体后,细胞结环率明显下降,见表3。加入GEIF后观察到,T淋巴细胞结环率明显提升(P<0.01),并且超滤法与透析法相比提升效果更好(P<0.001)。

2.4　超滤法与透析法GEIFT淋巴细胞转化率比较73中国生化药物杂志Chinese Journal of Biochemical Pharmaceutics 2004年第25卷第2期在对超滤法和透析法生产出的同一Mr的GEIF做T淋巴细胞转化率检测时发现,实验组与对应的空白组(生理盐水)比较均有明显差异(P<0.01);有丝分裂原PHA组与空白组比较差异极其显著(P<0.001);比较两种方法T淋巴细胞转化效果时发现,超滤法比透析法效果更好(P<0.001),见表4。

3　讨　论

GEIF是一种无色透明液体,具有可透析性、可超滤性,无热原,是一种小分子多肽和核酸的复合物。本实验室运用PIF制备工艺,提取出了不同Mr(3 000、5 000、10 000)的GEIF,并对其理化性质(光谱、色谱、多肽含量、核酸含量、pH值等)和生物活性(Ea玫瑰花环恢复率、T淋巴细胞转化率、白介素-2、肿瘤坏死因子等)等相关指标进行了检测与研究。

本文针对不同Mr和不同工艺方法制备的GEIF做了活性研究。不同Ea玫瑰花环实验组与其相对应的脱受体组比较均有明显差异,T淋巴细胞转化率实验也获得了相似结果。这说明不同MrGEIF皆能增加T淋巴细胞表面受体活性,使脱受体后的T淋巴细胞表面受体活性增强,促进T淋巴细胞有丝分裂,促使其转化,使T淋巴母细胞数量增多,不同MrGEIF都具有增强细胞免疫功能,有可能是一种免疫增强剂。但各实验组之间却没有明显的差异,提示不同MrGEIF在增强脱受体后T淋巴细胞表面受体活性方面几乎是等效的。不同MrGEIF在促进T细胞有丝分裂,促使其转化,使T细胞增殖方面也是等效的。用高效液相色谱对Mr10 000的GEIF分析时发现有17个主要成分峰,而这些峰主要集中在Mr3000~5 000之间。对比活性分析提示,GEIF功能活性多肽可能就在Mr3 000附近的成分峰,对这部分活性多肽收集研究工作正在进行。