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 [摘 要] 目的 评价 6 个 miniSTR 基因座在 DNA高度降解检材中的法医学应用价值,并调查广东汉族人群 6 个 miniSTR 基因座的遗传多态性。方法 采用两个复合扩增 PCR 体系、四色荧光标记及毛细管电泳技术, 对 D1S1677, D2S441, D4S2364, D10S1248, D14S1434, D22S1045 基因座进行基因型检测。结果 6 个 miniSTR 基因座均获得了清晰的基因型分型结果，扩增片段均小于 120bp，分别检出 7、7、5、8、8、7 个等位基因和 14、11、11、19、12、14 种基因型，基因型分布均符合 Hardy- Weinberg平衡。6 个 miniSTR 基因座在广东汉族群体的个人识别率和非父排除率分别依次为 0.863、0.895、0.792、0.894、0.814、0.904 和 0.392、0.360、 0.353、0.568、0.378、0.513。10 例 Identifiler TM 试剂盒未能正确分型的高度降解 DNA样本，采用 6 个 miniSTR 基因座复合扩增体系检测均提高了分型成功率 结论 6 个 miniSTR 基因座荧光标记复合扩增体系在 DNA 高度降解检材的检测中具有较高的应用价值，并且在广东地区汉族群体中具有较好的遗传多态性。

[关键词] miniSTR；复合扩增；遗传多态性；降解 DNA

1 材料与方法

1.1 样本和 DNA的提取

216 份 EDTA 抗凝血采自居住广东潮汕地区的无血缘关系汉族个体，另选取日常检案 Identifiler TM 试剂盒(Applied Biosystems)未能正确分型的高度降解 DNA 样本 10 例（其中高度腐败尸体血 4 例、微量检材 3 例，浸泡尸骨肋骨、股骨 3 例，依次编号为 1～ 10）。采用 Chelex- 100 法 [9] 或酚氯仿法提取 DNA。

1.2 PCR 扩增

从文献[8] 获得 D1S1677、D2S441、D4S2364、 D10S1248、D14S1434、D22S10456 个 miniSTR 的引物序列，基本参数见表 1。采用 5’端引物标记法，正向引物 5’端分别标记 6FAM、HEX、TAMRA，参照文献[10] 在反向引物 5′端均额外添加 GTTCTT序列，其目的是保证“非模板性添加”完全，使产物峰尖锐，提高分辨效果。所有引物均由上海 invitrogen 生物技术有限公司合成、标记荧光。扩增使用 PTC- 200 型扩增仪(MJ Research,Waltham,MA)。扩增体积 37.5μL，DNA模板 0.5 ～2 ng，dNTP 200μmol/L，MgCl 2 1.5 mmol/L，Taq 酶（MBI，晶美）5.0U/L，缓冲液 1×PCR，上、下游引物浓度见表 1。热循环参数:95℃10min；94℃30s，56℃30s, 72℃45s共 32 个循环；60℃45min；4℃保存。

1.3 扩增产物的电泳检测及分型

PCR 产物利用 ABI310 基因分析仪检测分析。PCR 产物 0.5μL，加入 12μL甲酰胺中 （含 Genescan-500 ROX 内标 0.2μL），混匀编号，95℃变性 3min，放入 310 基因分析仪自动进样盘。电进样 15000V、5s,电泳 24 min，Data Collection 软 件 收 集 数 据 ， 应 用 GeneScanAnalysisSoftware3.7NT软件对电泳结果进行分析。对每个基因座的 2～3 个等位基因进行测序、确认后,获得等位基因核心序列的重复次数,按照国际法医血液遗传学会推荐的命名原则 [11] 对各基因座等位基因进行命名,并按文献[12]方法研制出两组 miniSTR 荧光复合扩增体系等位基因分型标准物。运行 GenoTyper 3.7NT软件分析数据，统计计算各等位基因的长度分布范围，建立自动分析命名模板。输入 Project数据,运行自动分析命名程序完成对样本的分型。

1.4 统计学分

析用直接计数法计算每个基因座等位基因频率和基因型频率，用promega 公司的统计学软件 Powerstats2.0 计算杂合度(H)、多态性信息含量(PIC)、匹配概率(PM)、个人识别率(DP)和非父排除率(PE)，按文献[13]方法进行 Hardy- Weinberg平衡检验。

2 结 果

2.1 等位基因频率与遗传多态性

本研究所建立的两组 miniSTR 基因座荧光复合扩增体系分型效果良好，无干扰分型的非特异性扩增产物，扩增片段长度均在 70～120bp 之间。216 名广东汉 族 无 关 个 体 中 ，D1S1677、D2S441、D4S2364、 D10S1248、D14S1434、D22S1045 基因座分别检出 7、 7、5、8、8、7 个等位基因和 14、11、11、19、12、14 种基因型，基因型频率分布经 χ 2 检验均符合 Hardy- Weinberg 平衡 （P>0.05）。216 名广东汉族个体 6 个 miniSTR 基因座的等位基因及频率分布、遗传多态性指标见表 2、表 3，累计个人识别率为 0.999998，累计非父排除率为 0.82。本研究的 6 个 miniSTR 与文献 [14] 报道的广东汉族群体 Identifiler TM 15 个 STR 基因座的杂合度比较见表 4。D22S1045 的观察杂合度仅次于 D2S1338、D21S11、D8S1179、FGA 基因座，杂合度最低的 D4S2364 基因座也高于 TPOX基因座。

2.2 高度降解DNA样本的检测

10 例 Identifiler TM 试剂盒未能正确分型的高度降解 DNA样本，利用本研究的 6 个 miniSTR 基因座复合扩增体系检测分型成功率较高。例如样本 1，用 Identifiler TM 试剂盒检测仅获得 Amelogenin、D5S818、 D8S1179、D21S11 等扩增产物片断较小的 3 个 STR 基因座分型结果，而本研究的 6 个 miniSTR 基因座均获得了清晰的结果，扩增产物峰高均大于 600RFU，未出现非特异性扩增产物峰，结果见图 1 和表 5。