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摘要:目的:提高人免疫球蛋白的纯度、热稳定性,缩短生产周期。方法:在原生产工艺的基础上将CohnⅡ的溶解液进行一步提纯,即进行一步乙醇冷沉淀,去除脂蛋白等杂蛋白。结果:改进后的生产工艺,人免疫球蛋白的纯度由原来的90%左右提高到98%左右,热稳定都有很大提高,57℃4h后略现乳光略加重,无凝胶化、无絮状物产生,制品成品检定合格即可发出,无须放置,缩短了生产周期。改进后的生产工艺效果显著,工艺可行。
关键词:人免疫球蛋白;乙醇冷沉淀
人免疫球蛋白的常规生产方法是利用Cohn氏法生产的组份Ⅱ,进行溶解、脱醇、配制、除菌等步骤进行生产。由于Cohn氏法的生产工艺对温度、pH、蛋白浓度、离子强度、乙醇浓度等因素要严格控制,如果生产条件控制不严格,将对血浆蛋白各组份的分离产生影响,使各组分不能彻底分离,影响制品的质量。原工艺生产的人免疫球蛋白原液在放置过程中,往往会有蛋白析出,有絮状物产生,需放置一段时间(至少3个月)使杂蛋白析出之后在再除菌滤过去除变性蛋白。这样加大了制造周期,并且制品的外观批次间的差异很大、稳定性差。为解决这一问题,作者将CohnⅡ溶解液再进行一次低温乙醇沉淀,去除脂蛋白等杂蛋白,结果表明经过一次低温乙醇沉淀后,制品的纯度提高,外观明显改进,稳定性较好。
1 材料与方法
1.1 材料CohnⅡ:本所低温乙醇法生产,批号20020303、20020302、20020403、20020504、20020605;乙醇:药用级;氢氧化纳、盐酸等均为分析纯;北京化学制剂厂;超滤器Millpor Prostak200超滤系统;高压液相色谱仪:Waters600;Γ计数器:西安二六二厂,型号:2003A。
1.2 方法
1.2.1 人免疫球蛋白制造工艺:CohnⅡ→溶解→脱醇→调制→除菌→放置→二次除菌→分装包装。
1.2.2 人免疫球蛋白的改进工艺:为在脱醇之前加一步乙醇第14卷第3期:622004年6月 生 物 技 术BIOTECHNOLOGY Vol·14,No·3:62Jun·2004冷沉淀,目的是去除其中残留的脂蛋白等杂蛋白,提高人免疫球蛋白的纯度,提高制品的稳定性。方法是将CohnⅡ用15—20倍的注射用水进行溶解,用NaOH调其pH至7.6+0.2,将液温降至0℃,在搅拌下加入50%乙醇(-15℃以下)使溶液乙醇含量最终至4%,放置至少6h,之后将上清液进行浓缩脱醇→调制→除菌→病毒灭活→除菌滤过→分装包装。
1.2.3 白喉抗体测定:采用PHA法。
1.2.4 抗—HBs抗体测定:采用放射免疫法[1]。
1.2.5 人免疫球蛋白纯度测定:采用醋酸纤维素薄膜法[1]。
1.2.6 IgG多聚体含量测定:采用高效色谱法[1]。
1.2.7 将CohnⅡ溶解液和经过低温乙醇沉淀后的上清液,进行人免疫球蛋白纯度测定(醋酸纤维素膜电泳法)。结果见表1。通过图1可以看到,新工艺将CohnⅡ中的白蛋白、脂蛋白等杂蛋白去除,使人免疫球蛋白的纯度大大提高。
1.2.8 将同一批的CohnⅡ分成两份,分别用原工艺和改进工艺进行生产,然后对其纯度、外观、热稳定性、抗—HBs、白喉抗体、回收率等进行检测,结果见表2。
1.2.9 利用改进后的工艺进行5批生产,对其主要指标进行检测,结果见表3。
2 结果与讨论
各项检定方法依据《中国生物制品规程》[1]、卫生部有关规定[2]。
通过对CohnⅡ溶解液和乙醇冷沉淀上清液纯度比较(p<0.01)说明乙醇冷沉淀有效地去除了CohnⅡ中残留的脂蛋白等不稳定蛋白[3],通过图1可以看到,新工艺将CohnⅡ中的白蛋白、脂蛋白等杂蛋白去除,使人免疫球蛋白的纯度大大提高,见图1。用改进工艺生产的人免疫球蛋白结果可以看出,无论外观、纯度还是热稳定性都有改进和提高。通过用同一批CohnⅡ分别用原工艺和改进工艺生产的人免疫球蛋白的对比结果可以看出改进工艺生产的人免疫球蛋白其乳光明显减轻,纯度得到很大提高,热稳定性较好。利用改进工艺生产的5批人免疫球蛋白,外观均为轻微乳光,57℃4h后外观均为乳光,纯度为99.15±0.45%,制品的其他主要指标稳定,各项检定结果均达到较好的水平。
在原工艺的基础上加入的一步低温乙醇沉淀,去除CohnⅡ中不稳定的脂蛋白等杂蛋白,使制品稳定性加强,制品的整体质量有很大提高,因此,人免疫球蛋白的工艺改进效果明显,值得应用。
参考文献:
[1]中国生物制品规程[M]·北京化学工业出版社,2000.341,681-684·[2]卫生部司局.关于下发《血液制品成品澄明度检查细则和判定标准(试行)》的通知[Z]·卫药生发[1996]第245号.
[3]刘隽湘·输血疗法与血液制剂[M]·人民卫生出版社,2000.155-173·SNPs基因分型技术高爱保,肖剑,吴登俊(四川农业大学动物科技学院,四川雅安625014)摘要:介绍了SNP的概念、特点,集中讨论了各种技术的原理及优缺点,并对目前SNP在遗传图的绘制、疾病防治、药物设计及法医学等方面的应用及研究进展进行了综述。
