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中医对类风湿性关节炎( rheujmatoid arthritis, RA)的治疗积累了丰富的临床经验,但系统性、科学性不足。祛风除湿,活血解表是该类复方常用的配伍规律。为探讨中药治疗RA的配伍规律,我们选取在治疗类风湿性关节炎临床使用频率最高的解表药 (麻黄)、祛风湿药(川乌)、活血药(当归)作为研究对象[1]。为增强药物的疗效,我们将上述药物配伍成药对合剂:解表合剂 (麻黄-桂枝)、祛风湿合剂(川乌-草乌)、活血合剂(当归-川芎)、复方合剂(上述药物配伍而成)。通过给患有佐剂性关节炎 (AdjuvantArthritis,AA)的W istar大鼠灌胃不同的药对合剂或复方合剂,观察大鼠继发侧足爪肿胀体积、足爪浸液TNF-α、IL- 1β、PGE2水平,分析治疗效果、作用机制及发挥主要作用的药对组等。

1　材料

1. 1　动物与分组健康SPF级W istar雄性大鼠(合格证号: SCXK 鲁20080004)84只,体质量(250±50)g,购自山东大学实验动物中心,饲养1周后,随机数字法分为7组,每组12只,即正常对照组(N)、模型组(M)、地塞米松组(D)、复方组(FF)、祛风湿组 (QFS)、解表组(JB)、活血组(HX)。

1. 2　试剂与药物

1. 2. 1　试剂卡介苗80 mg/ml(北京生物制品研究所 2008040801),不完全弗氏佐剂(Sigma公司);大鼠TNF -α ELISA试剂盒、大鼠IL-1βELISA试剂盒、大鼠PGE2ELISA试剂盒(赛尔斯生物制品公司);自治足爪容积测量仪;ThermoMul- tiskanMK3酶标仪(北京惠安泽泰科技有限公司)。

1. 2. 2　药物及制法中药麻黄、桂枝、制川乌、制草乌、当归、川芎购自莱阳市江波大药房,由山东中医药高等专科学校中药鉴定教研室鉴定全部合格。醋酸地塞米松片,国药准字H20055075,青岛国风高科技药业股份有限公司产品。解表合剂由麻黄与桂枝按1∶1组合,制成生药含量1 g/ml 的水煎液;祛风湿合剂由制川乌与制草乌按1∶1组合,制成生药含量0. 35 g/ml的水煎液;活血合剂由当归与川芎按3∶2组合,制成生药含量1. 4 g/ml的水煎液;复方合剂由麻黄、桂枝、制川乌、制草乌、当归、川芎按3∶3∶1∶1∶4∶2比例组成,制成生药含量2. 7 g/ml的水煎液;以上各组合剂水煎液在本校药剂实验室完成。地塞米松在灌胃前制成浓度为0. 125 mg/ml溶液。

2　方法

2. 1　模型制备参考文献,正常对照组每只大鼠左侧足爪皮内注射生理盐水0. 1 m,l其余每组每只大鼠左侧足爪皮内注射卡介苗浓度为10 mg的CFA 0. 1 m,l制备佐剂性关节炎大鼠模型[2]。

2. 2　给药方法AA大鼠从注射CFA当天开始给药,各组大鼠给予不同的药物,给药方法灌胃。药量参按动物的体表面积折算大鼠用量:大鼠药用量(g/kg)=人的药用量×0. 018×5。人的药用量参照田代华主编《实用中药辞典》[3],地塞米松片的用量参考药物说明书。本实验中大鼠药实际投药量5倍于计算所得大鼠用药量。即:大鼠实际用量(g/kg) =大鼠用药量(g/kg)×5, 经计算可得,正常组给予灌胃蒸馏水4 ml/d,模型组灌胃等量蒸馏水,地塞米松组灌胃地塞米松悬浊液0. 5 mg/ (kg·d),祛风湿组灌胃川草乌合剂1. 4 g/ (kg·d),活血组灌胃归芎合剂5. 6 g/ (kg·d),解表组灌胃麻桂合剂4. 0 g/(kg·d),复方组灌胃复方合剂10. 8 g/(kg·d)。给药时间22 d。

2. 3　指标检测

2. 3. 1　足爪肿胀体积的测量用自制的大鼠足爪容积测量仪, 于第11天开始隔日测右足爪容积。按下述公式计算足爪肿胀度: S(% )=(BV-AV) /AV×100%。注: S为足爪肿胀度,AV注射佐剂前的容积,BV注射佐剂后的容积。 2. 3. 2　右侧后足爪前列腺素(PGE2)、白介素-1,β( IL-1β)、肿瘤坏死因子(TNF-α)的检测[4]大鼠造模的第22天,乙醚麻醉后处死大鼠,在右侧踝关节上0. 5 cm处剪下炎性足爪,纵向切开,放入盛有生理盐水5 ml的试管中, 4℃浸泡24 h,离心浸泡液,取上清液,放入-20℃冰箱中保存待测。采用酶联免疫吸附 (ELISA)法,按试剂说明书的方法,测定右侧足爪浸液TNF-α、 IL-1β、PGE2水平。

2. 3. 3　统计学处理计量资料以-x±s表示,各参数的比较使用 SAS9. 0统计软件中单因素方差分析程序检验各组间差异显著 ·1716· 时珍国医国药2010年第21卷第7期LISHIZHENMEDICINE ANDMATERIAMEDICA RESEARCH 2010 VOL. 21 NO. 7性,组间比较采用dunnett检验。

3　结果

3. 1　继发侧足爪肿胀体积变化从表1可以看出,与模型组比较,复方组、地塞米松组、祛风湿组、解表组、活血组右侧足爪肿胀度明显缓解,其中复方组、地塞米松组、祛风湿组作用最强(P< 0. 01),解表组和活血组次之(P<0. 05)。组间比较显示,从治疗后第13天开始,复方组、地塞米松组、祛风湿组的治疗效果基本相同。与复方组比较,祛风湿组、地塞米松组与复方组在治疗效果上无统计学差异(P>0. 05),活血组对足爪肿胀抑制程度弱于复方组(P<0. 05),解表组的抑制作用最弱,且与复方组有显著统计学差异(P<0. 01)。

3. 2　造模第22天各组大鼠足爪浸液炎性因子水平的比较

3. 2. 1　各组大鼠足爪浸液TNF-α水平的比较从表2看出,模型组AA大鼠足爪浸液TNF-α水平明显高于正常组(P< 0. 01),复方组、祛风湿组、地塞米松组TNF-α水平明显低于模型组(P<0. 01),活血组和解表组的TNF-α水平与模型组无明显差异;另一方面,各投药组间,活血组、解表组足爪浸液TNF- α水平显著高于复方组(P<0. 01),祛风湿组、地塞米松组与复方组足爪浸液TNF-α水平无统计学差异(P>0. 05)。与模型组比较,*P<0. 05,**P<0. 01;与复方组比较,★P<0. 05,★★P<0. 01 3. 2. 2　各组大鼠足爪浸液IL-1β水平的比较从表2看出,模型组AA大鼠足爪浸液IL-1β水平明显高于正常组(P<0. 01); 复方组、祛风湿组、地塞米松组IL-1β水平明显低于模型组(复方组、祛风湿组P<0. 05,地塞米松组P<0. 01)活血组和解表组的IL-1β水平与模型组无明显差异;另一方面,各投药组间,祛风湿组、地塞米松组IL-1β水平与复方组无统计学差异(P> 0. 05),活血组、解表组与复方组无统计学差异(P>0. 05)。与模型组比较,*P<0. 05,**P<0. 01;与复方组比较,★P<0. 05,★★P< 0. 01;n=12

3. 2. 3　各组大鼠足爪浸液PGE2水平的比较从表2看出,模型组AA大鼠足爪浸液PGE2水平明显高于正常组(P<0. 01),地塞米松组、复方组、祛风湿组PGE2水平明显低于模型组(P< 0. 01),解表组PGE2水平明显低于模型组(P<0. 05),活血组 PGE2水平与模型组无统计学差异(P>0. 05);另一方面,各投药组比较:祛风湿组、地塞米松组PGE2水平与复方组无统计学差异(P>0. 05),活血组PGE2水平明显高于复方组(P<0. 05),解表组PGE2水平与模型组无统计学差异(P>0. 05)。解表组 PGE2水平明显低于模型组(P<0. 05),活血组PGE2水平与模型组无统计学差异。

4　讨论

RA的病因与发病机理尚未完全阐明,但目前公认在RA的发病中,巨噬细胞和成纤维细胞是RA慢性期主要驱动力量,尤其滑膜巨噬细胞合成的IL-1β、TNF-α承担特殊的中心角色。它们刺激滑膜成纤维细胞增生和分泌IL-6、GM-CSF及趋化因子、以及效应分子如基质金属蛋白酶和前列腺素等,并可导致持续性滑膜炎。病人体内的PGE2水平明显升高,其炎症组织中含有大量的PGE2, PGE2可诱导IL-1、IL-6的产生。而且这些细胞因子之间往往相互影响、相互作用,形成网络并互相影响,共同参与RA的发病[5]。本次实验中,川草乌合剂对AA关节炎的右侧足爪肿胀都有明显的抑制作用。与复方组治疗效果无差异,同时川草乌合剂能显著抑制足爪内TNF-α、IL-1β、PGE2水平;在复方配伍中可能发挥主要的治疗作用。此次实验在一定程度上为临床重用川乌、草乌治疗RA提供了实验依据和支持。麻黄桂枝合剂对佐剂性关节炎的右侧足爪肿胀有一定的治疗效果,与复方组比较,效果明显不如复方组;麻黄桂枝合剂对足爪内TNF-α、IL-1β的抑制作用不明显,但对足爪PGE2水平有一定的抑制作用。川芎当归合剂对AA关节炎的右侧足爪肿胀有一定的治疗效果,与复方组比较,效果明显不如复方组;活血组大鼠足爪内 TNF-α、IL-1β、PGE2水平与模型组无差异。复方合剂对AA关节炎的右侧足爪肿胀都有明显的抑制作用,与地塞米松组治疗效果无差异,同时复方剂能显著抑制足爪内TNF-α、IL-1β、PGE2水平。综上所述,复方合剂的效果明显优于活血合剂和解表合剂, 与祛风湿合剂无差异,这说明祛风湿药物川乌与草乌在复方中发挥主要的作用,其作用机制是复方合剂能明显抑制足爪内TNF- α、IL-1β、PGE2水平表达。