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TNF-α 是一种由巨噬细胞分泌具有多种生物学活性的细胞因子，具有神经营养因子作用和类递质作用，可调节干预神经元细胞的发育生长。 骨髓间充质干细胞是存在于成年动物骨髓中具有多向分化潜能的非造血干细胞，众多研究表明其在体内外能够分化成为神经细胞，而使其成为细胞替代疗法的重要种子细胞来源。本实验观察低浓度 TNF-α 作用后，骨髓间充质干细胞向神经细胞分化的情况，探讨 TNF-α 诱导骨髓间充质干细胞向神经细胞分化的可能性。

材料与方法

1 材料

1.1 实验动物 新生 SD 大鼠乳鼠，清洁级，雌雄不限，购自南昌大学医学院动物部。

1.2 主 要 试 剂 及 仪 器 human TNF -α (pepro-Tech)，α-MEM 培养基 (Invitrogen， 美国 )， 胎牛血清(杭州四季青)，兔抗 Nestin 多克隆抗体(Chemicon，美国)，兔抗神经元特异性烯醇化酶(NSE)多克隆抗体(Chemicon，美国)，胰蛋白酶(Gibco，美国)，FITC 标记羊抗兔 IgG(Sigma，美国)，Fieoll-Paque 淋巴细胞分离液(天津血液研究所)。荧光显微镜(IX71，奥林巴斯公司，日本)。

2 方法

2.1 MSC 分离和培养 取出生三天的 SD 大鼠乳鼠，断颈处死，无菌条件下取四肢骨髓，以淋巴分离液经密度梯度离心分离细胞，收集单个核细胞层细胞，按 1×106接种于细胞培养瓶中，以含 10%胎牛血清的 α-MEM 培养基进行纯化和扩增培养。 每 3d 换液， 待原代培养的细胞接近 90%融合时， 以 0.25%EDTA-胰蛋白酶消化传代 。 采用免疫荧光及 RT-PCR方法鉴定间充质干细胞的标志 CD29+，CD34-。

2.2 TNF-α 诱导 rMSC 向神经细胞分化 取生长至第 3 代的 rMSC，以 5×105接种于预先放置了盖玻片的 24 孔培养板中，以含 10%胎牛血清的 α-MEM培养基于 5％ CO2温箱 37℃培养。 取生长状态良好的细胞随机分成两组(每组设三个复孔)：空白对照组(培养基中不含诱导剂)和 TNF-α 组(培养基中含TNF-α 5ng/ml)，6h 后收集各组细胞，待测。

2.3 神经细胞特异标志检测 将贴附了细胞的盖玻片取出，以 3%多聚甲醛固定 15min，1%牛血清白蛋白 37℃封闭 30 分钟以减少非特异性结合。 分别加 1:100 稀释的兔抗 Nestin 多克隆抗体和兔抗神经元特异性烯醇化酶(NSE)多克隆抗体，于 37℃孵育 2小时，同时设不加一抗的阴性对照。PBS 缓冲液漂洗3 次后, 加入 FITC 标记的羊抗兔 IgG(1:200)于 37℃孵育 1 小时，漂洗后，缓冲甘油封片。 荧光显微镜下观察结果并拍照。

结 果

1 rMSCs 的生长情况及鉴定原代分离的 rMSCs 培养 48h 后换液弃去未贴壁细胞，镜下可见有少许已贴壁的圆形、多角形和短梭形的散在单个细胞。 2～3d 后细胞开始缓慢分裂、增殖。 第 3d 后细胞增殖加快，贴壁细胞呈团簇集落样生长，呈成纤维样细胞形态(图 1a)。 7～10d 细胞集落扩大逐渐铺满瓶底达到融合状态(图 1b)。 传代培养的细胞形态与前代基本相同，但增殖速度明显增快。 免疫细胞化学染色结果显示，CD34 呈阴性表达(图 1c)；而约 90%以上的细胞 CD29 呈阳性表达，胞浆呈绿色荧光(图 1d)。

2 TNF-α 诱导 rMSC 向神经细胞分化

加入含 TNF-α 的诱导培养液后 3h 即可见细胞形态明显改变，多数细胞胞体收缩变圆，立体感增强，有突起长出。 6h 后，细胞伸出较多的细长突起，并出现分支，细胞折光性强，细胞间突起相互连接，交错成网，表现出典型神经细胞样形态(图 2)，

对照组细胞形态无变化。 免疫细胞化学染色对神经细胞标志物表达定性分析显示：诱导培养 6h 的 MSC 中，可见绿色荧光信号大多数位于细胞胞浆，对照组细胞荧光很弱，仅模糊的细胞轮廓，说明 TNF-α 诱导组大多数细胞表达神经前体细胞标志物巢蛋白nestin 和神经元特异性烯醇化酶 NSE， 对照组细胞nestin 和 NSE 均呈阴性表达(图 3)。

讨 论

中枢神经系统疾病导致的损伤中，神经元细胞破坏后难以再生[1，2]，尽管成年脑内有神经干细胞存在，但不足以弥补损伤神经元细胞的缺失，现有的临床治疗都无法恢复受损伤的中枢神经系统内神经细胞的数量，通过移植新的细胞以代替那些因为损伤或病变而失去生理功能的神经元细胞，从而修复神经系统的结构和功能成为能够彻底治愈中枢神经系统疾病的全新策略。 作为神经细胞的供体来源，干细胞的定向诱导分化成为目前研究的焦点。

骨髓间充质干细胞是存在于骨髓中区别于造血干细胞的一种具有自我更新及多向分化潜能的干细胞，由于其来源广泛、取材简单、体外培养扩增迅速，免疫原性弱，并且移植入体内后能自动到达受损神经中枢，在中枢神经系统微环境的影响下分化为神经样细胞达到修复组织的作用，在体外也可通过定向诱导向神经细胞转化， 因而 MSCs 成为中枢神经系统疾病的细胞治疗和损伤的修复的理想细胞来源，具有广阔的临床应用前景。

肿瘤坏死因子是一种多效细胞因子，具有广泛的生物学功能。不仅参与机体免疫系统功能的调节，而且可影响睡眠、摄食、发热、神经内分泌等多种中枢神经系统的活动，神经元和神经胶质细胞均可产生 TNF-α 并存在相关受体[3]。 有研究发现 TNF-α 可提高体外培养的 NSCs 后代中神经元的比例[4]，提示TNF-α 可能在神经细胞的发育、分化中扮演重要角色。本实验以低浓度 TNF-α 作用 3h 即观察到 rMSC均基本表现为神经样细胞形态，诱导 6h 后细胞间细长突起相互连接，交错成网状，同时观察到大多数细胞呈神经前体细胞标志物巢蛋白 nestin 和神经元特异性烯醇化酶 NSE 阳性表达， 表明 TNF-α 可体外诱导骨髓间充质干细胞向神经细胞分化，这为探寻高效诱导分化的培养体系提供了新的思路。 而且由于骨髓间充质干细胞向神经细胞定向分化的机制还有很多是未知的，对于本研究的探讨和其具体机制的认识将有助于进一步理解 MSCs 的定向分化机制从而为其在神经系统疾病的临床治疗应用提供理论依据，值得继续研究。