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[摘要]　神经干细胞是指具有分化为神经元、星形胶质细胞、少突胶质和对疾病损伤具有反应性修复潜能的细胞。神经干细胞的发现对神经系统的难治性疾病的治疗带来了希望。然而,内源性神经干细胞的数量在机体内特别是在成体内存在极少,使其在反应性疾病损伤中的修复作用体现非常有限,因此,体外有效培养和扩增神经干细胞仍然是目前科研工作者获取神经干细胞的主要手段。本文就影响神经干细胞培养的主要影响因素如取材、分离培养、接种密度及传代纯化方法等方面进行分析,为神经干细胞的体外培养提供参考。

[关键词]　神经干细胞;分离;细胞培养

长期以来人们一直认为高等动物的的神经细胞是终身存活的,成熟的神经元是终末细胞,如果神经元细胞受损伤死亡,只有由神经胶质来填充,其功能将永久丧失。然而神经干细胞的发现打破了这种传统的认识,目前研究发现,内源性神经干细胞具有对疾病损伤的反应性,在疾病损伤时能向损伤部位迁移、并增殖分化为有功能的神经元,这使得医学者对中枢神经系统损伤和退行性疾病的治疗看到了新的希望。由于内源性神经干细胞对疾病损伤修复的能力有限,因此神经干细胞的移植治疗仍然是目前神经系统疾病治疗中的主要细胞来源。成功培养神经干细胞是该研究和应用的基础和前提,本文就当前国内外的神经干细胞体外培养方法及影响因素做如下综述。

1　神经干细胞的生物学特征神经干细胞(Neural stem ce11s, NSCs)属于多能干细胞。等通过实验首先证实它的存在,并提出了神经干细胞概念[1]。近年来已经从胚胎及成年动物的中枢神经系统脑室下区、齿状回的颗粒下区、纹状体和脊髓的室管膜下区等部位分离、纯化出神经干细胞。神经干细胞具有自我更新的能力和多分化的潜能,可以分化成神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞促进修复损伤的神经,并且能够利用其迁徙特性在脑实质内弥散较远的距离,在结构上与宿主体内整合,且无免疫原性反应,所以神经干细胞除了神经替代作用,还可作为中枢神经系统基因治疗的载体细胞。神经干细胞的这些特性使其在治疗中枢神经系统损伤性疾病及其伤后功能重建方面有巨大的应用前景。

2　神经干细胞的原代培养

2·1　供体年龄和取材部位的影响　供体年龄对神经干细胞的纯度的有一定影响。实验研究显示,胚胎鼠大脑皮质中的神经干细胞数量明显高于新生鼠,且胎龄为12~15d左右的鼠胚胎体内神经干细胞的分化能力最强,这与神经干细胞在大鼠胚胎内增殖分化时间一致,即在第11天生成,第15天数量达高峰,以后逐渐减少直至新生个体出生[2]。取材部位对神经干细胞的纯度也有影响。不同部位来源的神经干细胞增殖活力明显不同,而且维持增殖活力的时间也有差异[3]。张在金[4]等发现,相同胎龄,从脑室下区分离的神经干细胞传代次数和增殖活性明显强于从海马、纹状体、皮层分离的神经干细胞。

2·2　分离方法对神经干细胞的纯度影响　(1)胚胎或新生神经组织的分离常采用机械分离法,将组织块用眼科剪尽量剪碎,加入少量培养液,用加样器轻轻吹打到肉眼看不到明显的组织块为止,再用200目筛网过滤即可得到含神经干细胞的单细胞悬液。也可以用注射器内芯研磨组织通过不锈钢筛网或将组织放在注射器内通过针头压出,但该方法对组织损伤较大。(2)对于成年神经组织的分离常采用酶消化分离法,因为成年神经组织中神经细胞间连结紧密、突触联系非常发达、且轴突纵横交错成一个立体三维网络结构,因此用机械方法很难将其分离。目前广泛应用的是0·25%胰蛋白酶与0·02% ED-TA1: 1混合使用。将组织块用眼科剪充分剪碎后,吸入离心管,加入消化酶约1m,l置37°C消化15min,中间摇晃一次,用等量含10%胎牛血清的培养基终止消化,吸管吹打混匀, 200目筛网过滤后离心加入培养基重悬即可得到含神经干细胞的单细胞悬液。

机械分离法和消化分离法两者都各有缺点,消化分离法消化酶的消化时间不易掌握,并且用于分离神经干细胞的消化酶对细胞都具有潜在的损害作用,可能会引起细胞表面一些神经生长因子受体丢失,而这些受体是神经干细胞维持未分化状态的关键因素。机械分离方法吹打的力度和次数也不易掌控,机械切割作用会使细胞活性降低,可用短期胰蛋白酶消化后再加以适当机械吹打,既能分离获得大量细胞,减少细胞死亡。近几年由于流式细胞仪分选技术的成熟,利用一些神经干细胞特异的表面抗原CD33+/CD34+/CD45+直接从神经细胞悬液中分选出神经干细胞[5]。还有利用免疫磁珠法从胚胎大鼠脑中成功分离出神经干细胞,干细胞蛋白检测阳性细胞纯度达到90%[6]。

2·3　接种密度对神经干细胞的纯度影响　与其他细胞相比,神经干细胞的生长更具有密度依赖性。赵志英等提出神经干细胞的最佳接种密度至少为1×105个/ml。一般以5×105个/ml的细胞密度进行接种甚至可以达到1×106个/m,l在5%CO2、95%湿度、37℃培养箱中培养将更有利于神经干细胞增殖[7]。神经干细胞通常根据培养液颜色变化和细胞生长情况每2~3 d换液一次。由于神经干细胞呈悬浮生长,换液时要离心弃去上清液再加入新鲜培养基重悬细胞后再接种。Chang等试验结果发现半量换液的方法优于全量换液,这是因为神经干细胞的自我更新、激活、增殖和分化主要依赖于周围特殊的微环境,而细胞正在增殖中具有自分泌作用,分泌的细胞因子同样也可以影响周围的其他细胞。采用半量换液的方法可以最大程度地使细胞生存环境保持稳定,有利于细胞生长[8]。

2·4　血清对神经干细胞的培养的影响　血清中含有很多未知的促分化因子,为去除血清中可能诱导神经干细胞分化的生长因子等干扰因素,神经干细胞的体外培养基通常采用含有表皮生长因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、白血病抑制因子(LIF)等生长因子和谷氨酰胺以及B27或N2等辅助因子的DMEM /F12 (1: 1)基础培养基,选择性促进神经干细胞增殖。历俊华[9]等应用1O%胎牛血清DMEM /F12培养基预培养48h后,再换为不含血清培养基培养神经干细胞,神经干细胞的聚球速度明显加快,可提前2~3 d收获神经干细胞球。血清预培养加速神经干细胞聚球原因,可能与血清中的某些成分可加速神经干细胞的表面粘附性有关,但确切机理还有待进一步研究。

3　神经干细胞的传代培养

3·1　传代时间的选择　提高神经干细胞的克隆形成率和形成速度是传代培养神经干细胞的关键。神经干细胞经过原代培养后,细胞数量大量增殖,形成神经球直径逐渐增大,毕将导致球中心的神经干细胞因缺乏营养而死亡,因此及时进行传代是防止其衰老死亡的关键,文献报道一般选用原代培养5~7d时进行,既避免细胞过度增殖而死亡,同时也保持细胞增殖的活性。