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人牙周膜细胞(human periodontal ligament cel,l HPDLC)是牙周组织的重要组成部分,在维护牙周组织的健康中起着重要作用。LPS是牙周病的主要致病物质,研究证实LPS能抑制牙周膜细胞增殖,并可诱导牙周膜细胞分泌IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α等炎症因子,在牙周病的发生和发展中发挥重要作用。中药野黄芩苷是从黄芩茎叶中提取的一种黄酮类化合物,有研究证明[1],野黄芩苷可通过抑制炎症因子的产生和释放而发挥抗炎作用。本实验旨在观察野黄芩苷对 LPS作用的人牙周膜细胞增殖和分泌肿瘤坏死因子-α 的影响,探讨其对牙周炎症的作用。

1　材料和方法

1. 1　主要试剂和仪器野黄芩苷(中国生物药品检定所),E. coliLPS (Sigma公司),DMEM培养液(Gibco公司),胎牛血清 (fetal bovine serum, FBS中美合资兰州民海生物工程有限公司),Ⅰ型胶原酶(Bejing Biotechnology),胰蛋白酶(中国医学科学院血研所科技公司),青霉素、链霉素、两性霉素B(华北制药股份有限公司), SP免疫组化试剂盒、波形丝蛋白和角蛋白单抗(北京中山生物技术公司),YT-CJ-1N型洁净工作台(北京亚泰科隆实验科技开发中心),倒置相差显微镜及照相系统 (Olympus,日本), CO2孵箱(Sanyo,日本), BIO-RAD 伯乐680型全自动酶标仪(美国),MTT、二甲基亚砜 (Sigma公司,美国),TNF-αELISA试剂盒(R&D公司,美国)。

1. 2　主要溶液配制野黄芩苷溶液的配制:取2 mg野黄芩苷溶于2 ml PBS中,NaHCO3调pH值至7. 4,至野黄芩苷完全溶解,成为1 mg/ml的储存液,过滤除菌,用含2% FBS ·534·实用口腔医学杂志(J PractStomatol)2010 Ju,l 26(4)的DMEM培养基将其稀释成所需浓度。 LPS溶液配制:取10 mg LPS,用含2% FBS的 DMEM培养基将其稀释、振荡,使充分溶解,并将其配成200μg/ml浓度,过滤除菌,备用。

1. 3　牙周膜细胞的来源、培养和鉴定选取承德医学院附属医院口腔科就诊12~18岁青少年因正畸拔除的正常前磨牙,用含青霉素、链霉素、两性霉素B的DMEM培养液充分洗牙,用刀片刮取牙根中1/3的牙周膜组织,Ⅰ型胶原酶摇床振荡消化至大部分细胞游离,吹打、分散,加入少量含胎牛血清的DMEM培养液,离心,弃上清液,将细胞和组织收集到培养皿中,置CO2培养箱中培养。原代培养成功后,常规换液,待细胞长至80%后,用胰蛋白酶消化传代。取生长良好的第3代HPDLC接种于盖玻片上培养,待细胞长至70%时,取出盖玻片,常规固定, SP免疫组化法进行波形丝蛋白、角蛋白染色,光镜观察鉴定、摄影。

1. 4　实验分组实验分为正常对照组、LPS组和野黄芩苷+LPS 组。正常对照组含2% FBS的DMEM培养液; LPS组含2% FBS的DMEM培养液+LPS;野黄芩苷+LPS 组含2% FBS的DMEM培养液+野黄芩苷+LPS,其中LPS的终末浓度为100μg/m,l野黄芩苷的终末浓度分别为0. 001、0. 01、0. 1、1、10μg/ml。

1. 5　MTT法测定HPDLC的增殖取生长良好的第6代HPDLC,用2. 5 g/L胰酶消化,调整细胞密度至2×103/m,l接种于3块96孔培养板,每孔100μl。常规培养24 h后,吸去培养液和未贴壁细胞,更换含不同药物的培养液,每孔加入各组溶液100μ,l每浓度复种6孔。标准环境下分别各孵育24、48、72 h后,向每孔内加入20μlMTT溶液(5 mg/ml),继续培养4 h。倒置显微镜下观察MTT结晶状况,然后弃去孔内上清液,每孔内加入150μl二甲基亚砜,振荡10 min后,在酶标仪下测定吸光度值 (A490),取6孔平均值,获得最佳增殖密度和培养时间。

1. 6　TNF-α的ELISA检测取对数生长期的第6代HPDLC,以3×104/ml的细胞密度接种于48孔培养板,每孔0. 5 m,l接种完毕后,标准环境下孵育24 h后,弃去培养液和未贴壁细胞,加入以上各组溶液0. 5 m,l复种4孔,标准环境下孵育1 d后,吸取上清, -20℃冰箱保存备用。分别将上述收集的细胞上清液常温下溶解。按照 ELISA试剂盒的说明书,各取200μl细胞上清液,分别加入包被了TNF-α一抗的ELISA 96孔板中,采用双抗体夹心法检测。终止反应后,用酶标仪检测450 nm波长的吸光度值(A450)。根据ELISA试剂盒中的 TNF-α标准品曲线,换算出所测定细胞上清液中 TNF-α的水平。

1. 7　统计学方法数据采用SPSS 11. 5统计学软件进行处理,组间比较采用单因素方差分析,两两比较用LSD-t检验,P < 0. 05表示有统计学意义。

2　结　果

2. 1　形态学观察原代培养细胞呈长梭形或星形,胞突细长,胞体丰满,胞质均匀,核圆形或卵圆形者为牙周膜细胞(图1)。

2. 2　免疫组化鉴定 HPDLC经免疫组化波形丝蛋白染色阳性(图2), 细胞胞质棕黄色着色;角蛋白染色阴性(图3),胞质不着色,说明细胞来源于中胚层。取免疫组化角蛋白染色阴性、波形丝蛋白染色阳性的第6代细胞用于实验。

2. 3　野黄芩苷对LPS介导的HPDLC增殖的浓度和时间效应图3角蛋白染色阴性(SP,×200) Fig 3　The negative expression ofkeratin in the cellplasma ofHP- DLCs (SP,×200) 　　从各实验组A值表1可见,培养液中加入100 μg/mlLPS时, HPDLC增殖活性明显受到抑制,与同期正常对照组相比,差异具有统计学意义(P<0. 05)。当同时加入0. 001~10μg/ml浓度的野黄芩苷后,对 LPS抑制HPDLC增殖活性有一定的拮抗作用。24 h 时,从0. 01μg/ml浓度的野黄芩苷起即显示出明显的增殖作用; 48 h时, 0. 001~1μg/ml浓度的野黄芩苷组,与只加LPS组比较,都具有极显著性差异(P< 0. 01);到72 h时,仅0. 1、1μg/ml浓度的野黄芩苷对 LPS抑制的HPDLC具有增殖作用。同时可见,各实验组24 h与48 h、72 h增殖活性相比具有统计学差异, 48 h后增殖作用出现缓慢现象,除LPS组,其它各组 48 h和72 h时HPDLC增殖活性无明显差别。并且在 24~72 h范围内,显示1μg/ml浓度的野黄芩苷促增殖作用最强,其在不同时间点与其它浓度的野黄芩苷组比较可见显著性差异。

2. 4　TNF-α的测定结果从表2看出, 100μg/mlLPS作用牙周膜细胞24 h,与正常对照组比较,能有效的刺激HPDLC分泌 TNF-α(P<0. 01)。同时加入0. 001~10μg/ml不同表1　野黄芩苷对LPS介导的人牙周膜细胞的增殖活性的影响 Tab 1　The effect of scutellarin on proliferative activity ofHPDLCs treated with LPS 药物分组A值(-x±s) 1 d　2 d　　3 d　　正常对照组0. 510±0. 094②0. 624±0. 076②③0. 710±0. 106①④ LPS组0. 262±0. 065 0. 381±0. 088 0. 552±0. 140④ LPS+0. 001μg/ml野黄芩苷0. 325±0. 033⑧0. 543±0. 101②④⑧0. 552±0. 092④⑦ LPS+0. 01μg/ml野黄芩苷0. 370±0. 114①⑧0. 594±0. 038②④⑦⑨0. 674±0. 135④ LPS+0. 1μg/ml野黄芩苷0. 439±0. 090②⑤⑦0. 685±0. 080②④⑥⑩0. 714±0. 075①④⑤ LPS+1μg/ml野黄芩苷0. 550±0. 141②0. 697±0. 105②0. 739±0. 129①③ LPS+10μg/ml野黄芩苷0. 430±0. 053②⑦0. 476±0. 093⑧0. 611±0. 189③ ①表示与同期LPS组比较P< 0. 05,②表示与同期LPS组比较P<0. 01;③表示与同组第1天比较P< 0. 05,④表示与同组第 1天比较P<0. 01;⑤表示与同期LPS+0. 001μg/ml野黄芩苷组比较P<0. 05,⑥表示与同期LPS+0. 001μg/ml野黄芩苷组比较P<0. 01;⑦表示与同期LPS+1μg/ml野黄芩苷组比较P<0. 05,⑧表示与同期LPS+1μg/ml野黄芩苷组比较P< 0. 01;⑨ 表示与同期LPS+10μg/ml野黄芩苷组比较P<0. 05,⑩表示与同期LPS+10μg/ml野黄芩苷组比较P<0. 01 浓度野黄芩苷,各浓度的野黄芩苷对LPS刺激TNF-α 分泌均有显著的抑制作用(P<0. 01),其中浓度为1 μg/ml时抑制作用达到最强,抑制率为62. 647%。

3　讨　论

HPDLC作为牙周组织的主要细胞群具有多种细胞生物学活性,在维护牙周组织的健康中起着重要的作用,其损伤会严重危害牙周组织的健康,阻碍牙周组织的再生与修复。LPS作为革兰阴性厌氧菌中所独有的一种致病物质,对牙周组织细胞具有很强的毒性和抗原作用,被认为是牙周炎症的重要病因之一,在牙周病的发展过程中起着重要作用。其致病机制一方面可能通过作用于牙周组织细胞而直接引起牙周组织的破坏,另一方面牙周组织细胞在LPS的刺激下,经过一系列信号传导,分泌IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α等炎症因子,启动免疫炎症反应,导致牙周组织的损伤[2-3]。

LPS的细胞毒作用直接影响着HPDLC的生长和增殖。以往有研究表明:LPS在0. 1、0. 01μg/ml低浓度时可促进细胞生长,而在10、100μg/ml较高浓度时明显抑制细胞的生长[4]。我们选择了对HPDLC的生长抑制作用的显效浓度100μg/ml。MTT结果显示:LPS组与同期正常对照组相比,细胞生长受到明显的抑制,其中24 h时抑制作用最明显。本实验观察不同浓度的野黄芩苷在不同时间点对LPS作用的HPDLC ·536·实用口腔医学杂志(J PractStomatol)2010 Ju,l 26(4)表2　野黄芩苷对LPS刺激HPDLC分泌肿瘤坏死因子-α的影响(pg/m,l-x±s) Tab 2　The effectofscutellarin on expression of tumornecrosis fac- tor-αinHPDLCs (pg/m,l-x±s) 分　组TNF-α抑制率(% ) 正常对照组11. 265±2. 301② LPS组72. 380±10. 927 LPS+0. 001μg/ml野黄芩苷47. 038±7. 403②35. 012 LPS+0. 01μg/ml野黄芩苷43. 885±5. 696②39. 369 LPS+0. 1μg/ml野黄芩苷30. 768±4. 236②57. 491 LPS+1μg/ml野黄芩苷27. 036±5. 360①②62. 647 LPS+10μg/ml野黄芩苷27. 233±5. 336②62. 375 ①与LPS+0. 001μg/ml和LPS+0. 01μg/m野黄芩苷组比较 P<0. 01,②与LPS组比较P<0. 01 增殖的影响,结果显示, 0. 001~10μg/ml野黄芩苷在不同的时间点,能明显的拮抗LPS对HPDLC的抑制作用,其中1μg/ml浓度作用24 h时效果最明显。

TNF-α是淋巴细胞、单核细胞及成纤维细胞等产生的一种多功能细胞因子,作为细胞因子网络中的关键成员,具有广泛的生物学作用。TNF-α在牙周炎发生过程中的主要作用是:作为始动因子启动炎症反应; 增加破骨细胞的形成和活性,促进牙槽骨的吸收;增加基质金属蛋白酶的产生,导致胶原纤维的破坏;刺激基质细胞的凋亡,限制牙周组织的修复等。因此阻断 TNF-α的分泌对牙周炎的防治具有重要意义。有研究显示[5], 1~100μg/ml的LPS均能刺激 HPDLC分泌TNF-α,在6~24 h内释放到上清液中的 TNF-α量随时间的延长和LPS浓度的升高而增高,24 h 后呈下降趋势。

因此我们的实验选择了LPS诱导作用最强的时间点24 h和LPS的最佳诱导浓度100μg/ml。结果证实: 100μg/ml的LPS作用牙周膜细胞24 h,能有效刺激牙周膜细胞分泌TNF-α,加入LPS同时分别给予0. 001~10μg/ml不同浓度野黄芩苷,观察不同浓度的野黄芩苷对LPS刺激HPDLC分泌TNF-α的影响,结果显示: 0. 001~10μg/ml野黄芩苷均能明显的抑制LPS对HPDLC的TNF-α分泌,其中1μg/ml浓度抑制作用最明显,抑制率为62. 647%。并且这一浓度与较低浓度的野黄芩苷组,如LPS+0. 001μg/ml、 LPS+0. 01μg/ml野黄芩苷组比较有极显著性差异。野黄芩苷为黄芩茎叶的提取物,是黄芩茎叶总黄酮中的主要活性成分。

现代药理研究证实黄酮类化合物在抗炎、抗变态反应,抗微生物,抗肿瘤等多方面都有一定的作用[6]。研究证实[7],黄芩对常见牙周细菌有明显的抑制作用。并有学者研究发现[8],野黄芩苷对MCF-7人乳腺癌细胞有促增殖作用,而且野黄芩苷可通过降低细胞凋亡蛋白酶3活性和抑制p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)磷酸化等途径保护大鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞免受氯化钴引起的凋亡[9]。但野黄芩苷对牙周组织细胞的影响尚未见研究报道。作为黄芩根的提取物,与野黄芩苷结构相似仅少一个羟基的黄芩苷。李会英研究证实,黄芩苷对LPS作用的牙周膜细胞有促进其增殖的作用,并可抑制细胞TNF-α 的分泌[10]。本实验研究的野黄芩苷对牙周膜细胞有与黄芩苷类似的保护作用,分析野黄芩苷可能通过直接降解LPS,从而促进牙周膜细胞增殖、抑制牙周膜细胞TNF-α分泌。但野黄芩苷是否具有直接促进牙周膜细胞增殖和抑制炎症因子TNF-α的产生和释放的作用还有待于进一步的研究。