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摘要:为了探讨大豆异黄酮对铝染毒小鼠血液和脑组织中神经递质的影响,将48只小鼠分为对照组、铝中毒组(腹腔注射氯化铝)和铝中毒的大豆异黄酮处理组,每组16只,试验持续60 d后测定小鼠血液、大脑皮质和海马中胆碱酯酶(AChE)活性,大脑皮质和海马中氨基酸类神经递质(Asp、Glu和Gly)含量。结果表明,试验期内大豆异黄酮显著提高铝中毒小鼠大脑皮质和海马中Glu和Asp含量,并降低血液、大脑皮质和海马中AChE活性以及海马中Gly含量。这说明大豆异黄酮可能调控中枢胆碱能和氨基酸类神经递质的代谢。

关键词:大豆异黄酮;铝中毒;氨基酸;胆碱酯酶

大豆异黄酮(soybean isoflavones,简称SI)是一类从大豆中提取的典型的植物雌激素,为杂环酚类化合物。它包括染料木黄酮(结构为5, 7, 4-三羟异黄酮)、大豆苷元(结构为7, 4-二羟异黄酮)和大豆黄素3种苷元及其衍生的9种苷类成分,具有多种保健和药理功效,包括雌激素样活性,以及抗氧化[1]、抑癌和抑制血管平滑肌收缩等,因而受到世界上许多科学家的重视。

铝是一种神经毒物,其神经毒性已经被许多研究所证实,但是关于它的具体作用机制仍然不清楚。胆碱能和氨基酸类神经递质含量的改变在脑组织损伤的神经毒性作用机制中具有重要意义。本试验研究采用氯化铝(AlCl3)溶液腹腔注射使小鼠染毒,观察大豆异黄酮对铝中毒小鼠的影响,同时对机体内乙酰胆碱酯酶(AChE)、中枢氨基酸类神经递质(Asp、Glu和Gly)等生理生化指标进行检测,以期探讨大豆异黄酮改善慢性铝中毒小鼠神经毒性的有关机制。

1　材料与方法

1.1　材料

1.1.1　试验动物　健康昆明种小白鼠,雌雄各半,体重18~22 g,由中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供,清洁级。

1.1.2　大豆异黄酮　含染料木黄酮和染料木苷22. 34%,大豆苷和大豆黄素17. 92%,由天津康宁生物化学工程有限公司提供。

1.2　方法

1.2.1　试验动物饲养及分组处理　试验期间各组小鼠置安静环境,分笼饲养,饲以普通饲料(由军事医学科学院实验动物中心提供,为全价固体普通饲料),自由摄食饮水。每日更换饮水和饲料,保持动物生活环境通风及清洁卫生。白天(12±2)h光照,室内温度(20±2)℃,相对湿度40% ~60%。小鼠适应喂养2周后,按性别随机分为3组:对照组、铝中毒组、铝中毒的大豆异黄酮处理组(大豆异黄酮量为60mg/kg,简称大豆异黄酮组)。每组16只,雌雄各半。铝中毒组小鼠用氯化铝100 mg/kg(结晶氯化铝用蒸馏水配制成10 g/L的水溶液,高压灭菌)腹腔注射, 0. 2 mL/只。对照组注射相同体积生理盐水,隔日1次,连续50 d[2]。将大豆异黄酮粉溶于0.5%羧甲基纤维素钠(CMC-Na)中配制成所需浓度,铝中毒的大豆异黄酮处理组按0. 3 mL/(只·d)的量灌胃,对照组和铝中毒模型组灌胃等量的0. 5% CMC-Na溶液,连续2个月。

1.2.2　生化指标的测定和方法　动物试验结束后,摘眼球采血(取血前禁食12 h),所得血液经4℃, 3 500 r/min, 15 min离心后制备血清。采血后断颈处死小鼠,在冰浴上开颅,迅速分离双侧大脑皮质和海马组织,用0. 01 mol/L磷酸盐缓冲生理盐水(PBS), pH值为7.25~7.35,冲洗除去残血,滤纸吸干表面水分。所有样品均于-70℃超低温冰箱保存。测定的指标及其方法如下:

血液胆碱酯酶(AChE)活性用碱性羟胺比色法测定,酶活性以30 min内0. 02 mL血液中水解乙酰胆碱(ACh)的量(μmol)为1个单位。脑组织中胆碱酯酶(AChE)活性用微量羟胺比色法,酶活性以每小时每克脑组织中水解乙酰胆碱(ACh)的μmol数为1个单位。脑组织中氨基酸类神经递质(Asp、Glu和Gly)含量采用柱前衍生高效液相色谱紫外吸收检测法[3],准确称量大脑皮质和海马,加0. 4 mol/L高氯酸冰浴中匀浆,离心后,加2. 0 mol/LKHCO3中和,离心,取上清,加2,4-二硝基氟苯(DNFB,进口分析纯,用乙腈配成1%溶液,避暗保存)衍生后,用0. 45μm微孔滤膜过滤,取20μL进样分析。紫外检测波长360 nm,以标准氨基酸浓度对峰面积作标准曲线,用外标法计算样品浓度。

1.2.3　数据处理与统计分析　生化指标的测定结果采用“均值±标准差”表示,用SAS 6. 12统计分析软件进行方差分析和Duncan’s多重比较,以便进行显著性检验。

2　试验结果

2. 1　大豆异黄酮对试验小鼠血液和脑组织中胆碱酯酶(AChE)活性的影响

由表1可以看出,与对照组相比,铝中毒组小鼠血液、大脑皮质和海马中胆碱酯酶活性显著升高(P<0. 05);而与铝中毒组相比,大豆异黄酮组活性明显降低,差异显著(P<0.05);大豆异黄酮组与对照组之间差异不显著(P>0.05)。

2.2　大豆异黄酮对试验小鼠脑组织中氨基酸类神经递质(Asp、Glu和Gly)含量的影响表2为试验小鼠大脑皮质和海马中氨基酸类神经递质含量的变化情况。

从表2可以看出,在大脑皮质中,与对照组相比,铝中毒组的Asp和Glu含量均显著降低(P<0. 05),而大豆异黄酮处理后含量有所升高;Gly含量在各组间的差异均不显著(P>0. 05)。在海马中,铝中毒组的Asp和Glu含量都比对照组显著降低(P<0.05),但大豆异黄酮处理后,含量升高,与对照组接近;铝中毒组和大豆异黄酮组的Gly含量都显著高于对照组(P<0. 05),而大豆异黄酮组显著低于铝中毒组(P<0.05)。

3　讨论

铝是一种神经毒素,进入脑内可取代Ca2+和Mg2+,同氨基酸链上的谷氨酸或精氨酸的羧基结合形成稳定的复合物而沉积在脑内。在大脑皮质、海马和杏仁核内富含谷氨酸能神经元,铝沉积于这些部位,引起双螺旋纤维蛋白的异常磷酸化,形成神经缠结及淀粉样蛋白前体,产生神经毒性[4]。

乙酰胆碱(ACh)是中枢神经系统的重要神经递质,它由胆碱乙酰化转移酶(ChAT)合成,乙酰胆碱酯酶(AChE)分解,重要的神经活动的完成常伴随着脑内ACh含量的变化。轻度认知障碍患者血清中AChE活性显著升高[5],造成ACh含量不足,导致中枢神经系统功能障碍,学习记忆能力降低;而抑制胆碱酯酶活力,可以降低痴呆发生率,改善学习记忆能力[6]。大脑皮质和海马被认为是记忆的主要结构基础,这些脑区均含有丰富的胆碱能神经元。本试验中小鼠铝中毒后大脑皮质和海马AChE活性升高,而大豆异黄酮可对抗这种变化,使AChE活性与对照组接近。这表明铝中毒后伴随着AChE活性的变化,大豆异黄酮可通过调节脑内AChE的活性,间接提高胆碱能神经递质ACh含量,从而改善中枢胆碱能功能。另外,本试验中大豆异黄酮亦能抑制小鼠外周血液胆碱酯酶活性,提示大豆异黄酮同样能影响外周血液中乙酰胆碱的代谢。乙酰胆碱作为一种分布很广泛的外周神经递质,对内脏及骨骼肌的活动也具有极为广泛的调节作用。