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流行性感冒简称流感,是由流感病毒( influenza virus)引起的急性呼吸道传染病,在流行病学上表现为发病率高、起病迅速、传染力强并伴有一定的死亡率。由于目前对流感病毒感染尚没有满意的防治手段,因此研究安全有效的抗病毒药物具有非常重要的意义。近年来,许多研究者在中药抗病毒研究方面做了大量工作,初步发现不少中药具有抗流感病毒作用[1, 2]。滨蒿Artemisia scopariaWaldst. etKit为菊科蒿属植物,维吾尔名“西瓦克”,是维吾尔医传统用药,性质二级干热,具有清热解毒、开窍化痰、消败津、除积物等功效[3]。民间常用滨蒿水煎剂预防感冒。本实验对滨蒿提取物进行抗流感病毒活性筛选,为深入研究滨蒿抗流感病毒作用的药效物质基础提供依据。

1　材料

1. 1　药物与试剂滨蒿样品由本实验室提供,体外实验时将样品用高纯水配制成1g/ml的原药液,过滤除菌后备用,实验时按需要做倍比稀释。体内实验时将样品用蒸馏水配制成所需浓度。利巴韦林片(RBV),江西汇仁药业有限公司产品,批号0911025; 乙醚,天津市化学试剂三厂产品,批号0705102;生理盐水:新疆制药厂产品,批号09080091。

1. 2　病毒株流感甲型病毒(济防90-15),流感乙型病毒(济防97-13),购自中国预防医科院病毒研究所,经本实验室在鸡胚尿囊腔内培养传代(2008. 1), -80℃保存。

1. 3　动物昆明小鼠,体质量18~22 g,♀♂各半。由新疆医科大学实验动物中心提供,动物合格证号:新医动字(新) syxk2003 -0001。

1. 4　细胞模型犬肾细胞MDCK细胞,购自中国预防医科院病毒研究所,经本实验室传代保存。

2　方法 2. 1　滨蒿的提取工艺[4, 5]为获得最佳提取部位,以不同极性的溶媒对滨蒿药材进行提取,采用水提醇沉、50%乙醇回流提取、 95%乙醇回流提取3种工艺路线: 滨蒿药材H2O回流提取→提取液浓缩→浓缩液醇沉 →药液浓缩减压干燥→样品(

H1) 滨蒿药材50%醇回流提取→提取液浓缩减压干燥→样品(H2) 滨蒿药材90%醇回流提取→提取液浓缩减压干燥→样品(H3) 经体外实验表明样品H1、H3均有明显的抗甲、乙型流感病毒作用,故对样品H1、H3继续进行分离纯化。样品(H1)AB-8柱50%醇洗脱→洗脱液浓缩减压干燥→样品(H4) 样品(H3)AB-8柱30%醇洗脱→洗脱液浓缩减压干燥→样品(H5)

2. 2　样品H1、H2、H3体外抗病毒实验[6~8]

2. 2. 1　样品H1、H2、H3对MDCK细胞的毒性实验样品配成最大浓度原液,以培养液作倍比稀释后加到已长成单层的MDCK ·799· LISHIZHENMEDICINE ANDMATERIAMEDICA RESEARCH 2011 VOL. 22 NO. 4时珍国医国药2011年第22卷第4期细胞培养板中, 100μl/孔,每稀释度4个平行孔,同时设正常细胞对照。置37℃、5% CO2条件培养4 d,逐日观察记录细胞生长情况,确定细胞不出现明显退变的最低稀释倍数(TC0),用 SPSS16. 0软件计算50%毒性浓度(TC50)。

2. 2. 2　样品H1、H2、H3对甲、乙型流感病毒致细胞病变的影响取已长成单层的MDCK细胞,吸弃培养液,接种病毒液50μ,l置 37℃、5% CO2条件培养吸附1 h后,吸弃病毒液,以不含FCS的维持液洗细胞表面2次。实验设正常细胞对照、病毒对照、利巴韦林对照和不同稀释度的样品组,每组4个平行孔。样品取TC0 以下的5个倍比稀释度加样, 100μl/孔,置37℃、5% CO2条件培养,逐日观察细胞生长情况。当病毒对照组细胞病变为4时开始记录结果,用SPSS16. 0软件计算半数抑制浓度( IC50)和选择指数(SI)。结果见表1。 -:细胞生长正常,无病变出现; ±:细胞病变少于整个单层的10%; 1:细胞病变约占整个单层细胞的25%以下; 2:细胞病变约占整个单层细胞的50%以下; 3:细胞病变约占整个单层细胞的75%以下; 4:细胞病变约占整个单层细胞的75%以上。选择指数(SI)=TC50/IC50。表1　样品H1、H2、H3体外抗甲、乙型流感病毒的作用样品编号 TC50 /μg·ml-1 对流感甲型 IC50/μg·ml-1SI 对流感乙型 IC50/μg·ml-1SI H1557. 4 86. 2 6. 7 121. 2 4. 8 529. 1 86. 2 6. 1 118. 7 4. 6 H2>2000 - - - - >2000 - - - - H3>2000 339. 0 >5. 9 526. 3 >3. 8 >2000 416. 7 >4. 8 476. 2 >4. 2 RBV 1732 4. 5 384. 8 13. 4 129. 2 1732 4. 2 412. 3 12. 5 138. 5 实验结果表明,样品H1、H3对甲、乙型流感病毒均有明显的抑制作用,其中H1对甲、乙型流感病毒的IC50分别平均为86. 2, 120. 0μg/ml, SI分别平均为6. 4, 4. 7;H3对甲、乙型流感病毒的 IC50分别平均为377. 9, 501. 3μg/ml, SI分别大于5. 4, 4. 0。故选择H1和H3继续纯化后进行抗病毒作用的筛选。

2. 3　样品H4、H5体外抗流感病毒实验

2. 3. 1　样品H4、H5对MDCK细胞的毒性实验方法同“2. 2. 1” 项。

2. 3. 2　样品H4、H5对甲、乙型流感病毒致细胞病变的影响方法同“2. 2. 2”项。结果见表2。表2　样品H4、H5体外抗甲、乙型流感病毒的作用样品编号 TC50 /μg·ml-1 对流感甲型 IC50/μg·ml-1SI 对流感乙型 IC50/μg·ml-1SI H4365. 7 38. 1 9. 6 79. 2 4. 6 327. 4 32. 4 10. 1 88. 7 3. 5 H5546. 2 97. 5 5. 6 321. 3 1. 7 552. 9 115. 2 4. 8 394. 9 1. 4 RBV 1732 4. 5 385. 2 15. 5 111. 7 1732 4. 3 405. 3 13. 6 127. 3 实验结果表明,样品H4较纯化前在体外抗流感病毒作用有所提高,尤其是对甲型流感病毒更为明显,其IC50平均为35. 3 μg/m,l SI平均为9. 9。而样品H5较纯化前在体外抗病毒作用没有提高。

2. 4　样品H4、H5体内抗流感病毒实验[6~8

] 2. 4. 1　样品H4、H5对流感病毒致小鼠死亡的保护作用取小鼠 84只,随机分为病毒感染对照组、利巴韦林对照药组和4个剂量 H4、H5的给药组,每组12只,各给药组按设定剂量ig给药, 2次/ d,连续6 d,对照组ig等量的蒸馏水。给药第3天各组小鼠用乙醚轻度麻醉后,以流感病毒液滴鼻感染, 0. 05ml/只。记录感染后小鼠的死亡数,计算死亡率、死亡保护率及平均存活天数、生命延长率。死亡率(% )=死亡动物数/动物总数×100%;死亡保护率(% )=(对照组死亡率-实验组死亡率) /对照组死亡率× 100%;生命延长率(% )=(实验组平均存活天数-感染组平均存活天数) /感染组平均存活天数×100%。结果见表3。4g/kg的给药剂量能明显延长小鼠的平均存活天数(P<0. 05)。滨蒿H5部位0. 4g/ kg的给药剂量能抑制流感病毒感染所致小鼠的死亡(P<0. 05), 其平均存活天数与模型对照组相比也能明显延长,但与模型对照组相比无显著性差异。表明滨蒿H4部位对流感病毒致小鼠死亡有明显的保护作用。

4　讨论

据报道,早在20世纪50年代,就有学者根据滨蒿清热等功效的记载,对其进行初步的抗流感病毒研究,并证明其粗提物在鸡胚外对原甲型流感病毒(PR8株)具有明显的抗病毒作用。另有文献报道,滨蒿水煎剂可用于预防感冒,此法于1970和1972 年流感流行时给人群服用,收到了良好的预防效果。本实验通过体外细胞培养法和体内建立病毒感染动物模型考察了滨蒿提取物及纯化后样品的抗流感病毒效果。体外细胞模型实验条件易控、方法规范、易于进行,可检测药物在细胞内或细胞外对病毒的直接作用。结果显示滨蒿H4、H5部位能有效抑制流感病毒CPE的产生,其中滨蒿H4部位抑制流感病毒CPE的作用更加明显。动物体内实验则更能反映滨蒿提取物及纯化后样品的整体疗效,动物模型表明滨蒿H4部位能降低病毒感染小数的死亡率,延长小鼠平均存活天数。提示滨蒿H4部位在体内外均具有明显的抗流感病毒作用。以上实验为深入研究滨蒿抗流感病毒作用的药效物质基础提供了一定的实验依据。