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【择

【摘要】  目标 切磋人工合成的CpG ODN对差异物种的免疫刺激活性，开拓具有广谱免疫刺激活性的CpG ODN。 要领 将特定的CpG ODN单独或与差异的抗原连系别离免疫鸡和小鼠，用ELISA检测差异时刻鸡和小鼠特异性抗体的滴度。 功效 CpG ODN均能诱导鸡和小鼠发生抗原特异性抗体，且抗体程度明明高于比较组(P<0.05)。结论 这种CpG ODN在必然水平上具有广谱免疫刺激特征。

【关键词】  CpG ODN；种属特异性；疫苗
　　
　　Abstract:Objective To investigate the immune stimulation activity of CpG oligodeoxynucleotides to different species and develop CpG oligodeoxynucleotides that possess broad-spectrum immune stimulation activity. Method Chickens and mice were respectively vaccinated with CpG oligodeoxynucleotides or synergistically with different antigens, and then titers of specific antibody in the blood serums of chickens and mice were detected with ELISA. Results CpG oligodeoxynucleotides could induce the generation of antigen specific antibody in chickens and mice, and the level of antibodies in groups which use CpG ODN as adjuvant is higher than that in the control group (P<0.05).  Conclusion CpG ODN that we made restrictively possesses broad-spectrum immune stimulation activity.

　　Key words:CpG ODN；multi?species specificity；vaccine

　　包括CpG基序的人工合成的寡核苷酸（ODN）作为免疫刺激信号可以被动物的免疫体系所辨认，随后CpG ODN刺激人类和多种动物发生自然的和得到性的免疫应答。CpG ODN首要通过TLR9活化免疫体系，发生Th1型免疫应答。因此，CpG ODN作为佐剂已普及应用于传染性疾病、肿瘤的提防和治疗［1］。但CpG ODN存在种属特异性题目，这一题目限定了动物尝试结论的外推性［2］。以是，探求和开拓具有广谱辨认特征的CpG ODN具有重要的应用代价。本文首要通过调查鸡和小鼠血清中特异性抗体的变革来评价CpG ODN对差异抗原的免疫加强结果，进而确定这种CpG ODN是否可以或许降服物种限定性这一题目。

　　1  原料与要领

　　1.1  原料

　　1.1.1  动物康健1日龄小鸡，康健50日龄SPF鸡，购自广东省农科院；2月龄BALB /c小鼠, 雌性, 体质量20 g阁下，购自南边医科大学尝试动物中心，及格证号：2003A074。

　　1.1.2  试剂10 mg/mL猪囊虫抗原、猪囊尾蚴DNA疫苗VTS76、VR1020、CpG ODN由本尝试室生涯［3,4］，SPA?HRP购自上海生物成品研究所。

　　1.2  动物分组及免疫方案

　　1.2.1  鸡尝试组取康健1日龄小鸡，随机分成A、B、C三个组，每组20只，各组豢养前提沟通。7日龄时各组处理赏罚如下：A为比较组，不作任那里理赏罚；B组滴鼻免疫VTS76疫苗（100 μg/kg）；C组滴鼻免疫VTS76疫苗（100 μg/kg）,并同时颈部皮下打针免疫佐剂CpG ODN（100 μg/kg），21日龄时B、C组按沟通的处理赏罚增强免疫1次。

　　1.2.2   BALB/c小鼠尝试组BALB/c小鼠60只, 随机分为3组, 每组隔断2周免疫2次。回收肌肉打针法, 将质粒DNA溶液打针到小鼠两侧股四头肌。A组打针VR1020 100 μg/kg作为阴性比较; B组打针VTS76 （100 μg/kg）; C组打针VTS76和CpG ODN各100 μg/kg。

　　1.3  抗原特异性抗体检测　　96孔作育板用碳酸氢钠缓冲液(15 mmol/L Na2CO3, 35 mmol/L NaHCO3, PH 9.6)恰当稀释的猪囊虫抗原包被，4 ℃留宿孵育。用含Tween?20的PBS(0.1 mol/L PBS，0.1% Tween?20)洗涤3次，每次3 min；每孔插手100 mL经PBS(0.1 mol/L PBS，1% BSA)恰当稀释的待测血清，37 ℃孵育2 h。PBS洗涤5次，每孔插手100 mL、1∶40稀释的SPA?HRP，37 °C孵育2 h。PBS洗涤5次，每孔插手100 mL TMB底物（含0.1 mg/mL 3’3’5’5’?四甲基联苯胺的磷酸盐?柠檬酸缓冲液，pH5.4，用前加5 mL 30% H2O2 10 mL），37 ℃孵育1 h。每孔插手50 mL H2SO4(0.2 mol/L)终止显色回响。Bio?Rad 3550测定A450读数。待测样品A值大于阴性比较均匀A值的3倍为阳性。

　　1.4  统计学说明　　各尝试组数据较量均回收方差说明，P<0.05为差别有明显性。

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