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医学论文范文:儿童贫血基因谱分析
儿童贫血基因谱分析
| 文章出自:免费论文 | 编辑:论文格式范文 | 点击: | 2013-04-21 19:02:32 |

α 地中海贫血( α-thalassemia,简称 α 地贫) 是由于 α-珠蛋白基因缺失或功能缺陷( 点突变) 而导致 α-珠蛋白链合成障碍的一种常染色体不完全显性遗传性疾病。我国南方是 α 地贫的高发区,研究资料表明广东地区 α 地贫的检出率为 8. 3%[1-2],已成为当今严重的公共卫生问题。本研究对我院确诊的 471 例儿童 α 地贫患儿基因缺失类型进行分析,探讨 α 地贫缺失型基因的分布特征,为确诊儿童将来的遗传咨询和婚育指导提供依据。

1 资料与方法

1. 1 研究对象

2009 年 1 月至 2011 年 7 月在佛山市妇幼保健院儿科门诊和儿童保健科就诊、体检的儿童中,将血细胞分析检测平均红细胞体积( MCV) < 82 fl 者纳入本研究。

1. 2 仪器和试剂

Sysmex XT-2000i 全自动血细胞分析仪由日本希森美康公司生产,XT-2000i 所用测定试剂由该公司提供。PCR 扩增仪为美国 BioRad 公司生产的icycler 扩增仪( 或美国 ABI 公司生产的 2720 扩增仪) ,DNA 抽提试剂盒、α 地贫 gap-PCR 基因诊断试剂盒由深圳亚能生物技术有限公司提供。

1. 3 方法

1 . 3 . 1 MCV 的测定 使用 Sysmex XT-2000 i全自动血细胞分析仪对全部受检儿童进行血细胞分析。

1. 3. 2 α 地贫基因分析 对经血细胞分析 MCV< 82 fl 者用无菌 EDTA 抗凝管抽取静脉血 2 mL,采用以缺 口 PCR( gap-PCR) 为 原 理 的 单 管 多 重PCR( multiplex PCR,M-PCR) 进行缺失型 α 地贫基因检测。( 1) PCR 扩增: 用全血( EDTA 抗凝) DNA 快速提取试剂盒按操作说明提取 DNA。单管 PCR 反应混合液为 21 μL ( 已含有 7 种引物、反应用酶1. 0 μL) ,加入待测样本 DNA 4. 0 μL,总反应体系为 25 μL。按以下条件循环: 96℃预变性 15 min; 然后 98℃变性 45 s,64℃退火 90 s,72℃ 延伸 3 min,共 35 个循环; 最后 72℃延伸 5 min。( 2) 电泳: 用 0. 5 × TBE 缓冲液配制 0. 8% 琼脂糖凝胶,以 Gold view 为染色剂,取 3 μL 扩增产物加于水平电泳仪上,恒压 5 V/cm,电泳约 1. 0 h,在紫外凝胶透射成像仪上观察。每次反应均设阳性对照、阴性对照、空白对照和 Marker。

1. 4 统计学分析

采用 SPSS 13. 0 统计软件包进行数据处理。计数资料采用率( %) 表示,不同性别 α 地贫检出率比较采用 χ2检验,不同年龄组 α 地贫检出率比较采用趋势 χ2检验。P <0. 05 为差异有统计学意义。

2 结果

2. 1 α 地贫检出率

血细胞分析示 MCV <82 fl 者 1341 例,其中男896 例,女 445 例,年龄为 0 ~ 14 岁。经 α 地贫基因检测,确诊 α 地贫患儿 471 例( 35. 1%) ,其中男302 例,女 169 例。不同性别患儿 α 地贫检出率差异无统计学意义( χ2= 2. 382,P = 0. 129) ; 不同年龄患儿 α 地贫检出率差异有统计学意义( χ2= 24. 88,P < 0. 01 ) ,随着年龄的增长,α 地贫检出率增加。见表 1,表 2。

2. 2 α 地贫基因型和基因频率

本反应体系可扩增出长度约为 1. 8 kbp、2 kbp、1. 6 kbp 和 1. 3 kbp 的 4 个条带,分别代表人类α-珠蛋白基因( 即正常人) 、3. 7 缺失型、4. 2 缺失型、SEA 缺失型的扩增产物。阴性对照管无扩增产物,阳性对照管出现长度约为 1. 3 kbp 和 1. 8 kbp的 2 个条带,分别为 --SEA缺失型和正常 α 珠蛋白基因扩增的产物。本组资料以 --SEA基因型最常见,占75. 3% ; 并以 --SEA/ аа 基因型多见,占 73 . 2 % ,其次为 аа/-а3. 7基因型( 12. 5% ) 和 --SEA/ -а3. 7基因型( 5. 5% ) 。见表 3 ~ 4。

3 讨论

α 地贫是一组常染色体单基因遗传性疾病,具有高度的遗传异质性和明显的地理分布特征,且发病率高,严重威胁儿童健康和影响我国人口素质。

不同程度 α 珠蛋白基因缺失导致不同的临床表型,并主要取决于 α 基因缺失的数目[3]。本研究对1341 例血常规 MCV < 82 fl 儿童进行 α 地贫基因检测,阳性结果 471 例,检出率为 35. 1%,明显高于文献报道[2,4-5],主要与本研究对就诊和体检儿童先进行血常规 MCV 初筛,MCV <82 fl 者才进行 α 地贫基因检测有关。本资料显示 α 地贫儿童男、女发病率差异无统计学意义,说明 α 地贫的发病与性别无关。作为常染色体遗传性疾病,α 地贫的发病并无年龄差异,但本组资料通过对 MCV <82 fl 者进行基因分析发现,随着年龄的增长,α 地贫的检出率增加,提示随着年龄增长,MCV 降低与地贫的一致性越高。婴幼儿 MCV 值降低除受地贫影响外,亦受缺铁性贫血的影响,婴幼儿是缺铁性贫血的高发年龄,而年长儿缺铁的发生率则明显下降,其 MCV 值受缺铁因素的影响亦明显降低。因此,MCV <82 fl 作为年长儿地贫的预测指标较婴幼儿更可靠。但是,儿童时期各年龄段 MCV 值具有动态变化,新生儿红细胞体积较儿童及成人大,出生时 MCV 值可大于94 fl,随 后 逐 渐 下 降,约 至 生 后 6 个 月 时 降 至70 ~ 84 fl,随后 MCV 的正常值逐渐上升,青春期达成人水平。考虑到 MCV 值作为血液学指标具有以上变化,必定会对 α 地贫检出率产生一定影响,因此以 MCV 值异常来预测地贫诊断,还需结合年龄因素进行综合分析。本研究未能根据 MCV 值的动态变化进行年龄分组研究,这是本研究的不足之处。

引起 α 地贫的基因异常有两种类型,即缺失型和非缺失型( 点突变) ,各地缺失型与非缺失型比例不同,缺失型约从 40% 到 70% 不等。在我国南方,引起 α 地贫的分子基础主要是 α-珠蛋白基因簇3 种缺失: ①右侧缺失型( -а3. 7) : 缺失一个3. 7 kb 的基因片段; ②左侧缺失型( -а4. 2) : 缺失一个 4. 2 kb的基因片段; ③东南亚缺失型( --SEA) : 同一染色体上2 个 α-珠蛋白基因全部缺失。-а3. 7缺失型和 -а4. 2缺失型统称为 α+地贫,--SEA缺失型称为 α0地贫。-а3. 7缺失型是全球分布最广、频率最高的基因型,而我国南方则以 --SEA基因型最常见。本研究对 MCV 值降低儿童进行上述常见的 3 种缺失型基因分析,检出471 例 α 地贫患儿中,以东南亚缺失型占主导地位,占 75. 3%,约是 -а3. 7和 -а4. 2两基因总和的 3 倍; α+地贫中以右侧缺失型( -а3. 7) 占优势,是左侧缺失型( -а4. 2) 的 2. 2 倍,与黄钰君等[6]报道结果相似。本研究显示儿童 α 地贫基因型以标准型最为常见,占73. 4% ,并以 --SEA/ аа 为主,占总数的 73. 2% ,与广州和珠海等地相似[5,7],明显高于昆明地区[8],说明α 地贫基因型分布具有明显的地理差异。HbH 病占 9. 3%,静止型占 17. 1%,两者基因型构成比均以右侧缺失型占多数,与基因频率的分布一致。本研究未能进行非缺失型检测是本研究的另一不足之处,在今后的临床研究中将进一步完善这方面的工作。

综上所述,本研究 471 例 α 地贫患儿基因缺失以东南亚缺失型占主导地位,基因型以标准型中的--SEA/ аа 多见。 本地区儿 童 出 生 缺 陷 性 疾 病 中α 地贫基因名列第 5 位[9],是高发的地方性遗传病,因此有必要对 MCV <82 fl 的儿童人群常规进行基因诊断,并建议建立 α 地贫基因网络档案库,为计生部门采取有效措施防止重型地贫患儿的出生提供参考依据。

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