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外阴鳞状细胞癌(vulvar squamous cell carcinoma, VSCC) 大约占女性外阴恶性肿瘤的 80%～。但很久以来, 其遗传学研究十分有限大多为已知单个癌基因或抑癌基因的突变和表达的相关性的报道, 国内外至今尚未发现外阴鳞癌相关基因克隆的报道。

比较基因组杂交技术是 Kallioniemi 等于年创建的一种新的分子遗传学技术, 可检测组织细胞中全部染色体区带上基因组间 DNA 拷贝数的变化并定位。利用 CGH 技术可以获得肿瘤组织中相应的癌基因的扩增及抑癌基因丢失的信息, 是肿瘤病因学研究的有效手段, 受到广泛关注。我们采用 CGH 技术分析 21 例外阴鳞癌的遗传变异, 有助于了解其癌变机理。

以期发现外阴鳞癌相关基因。方法: 应用 CGH 技术检测 21 例外阴鳞癌基因组的不平衡性即其 DNA 的扩增或丢失。结果: 外阴鳞癌常见的扩增染色体是。常见的丢失染色体是 4p 和 3p。结论: 外阴鳞癌细胞中存在多条染色体拷贝数的改变, 由此引起相应癌基因的扩增和抑癌基因的丢失可能参与了外阴鳞癌的发生、发展。

关键词: 外阴肿瘤; 比较基因组杂交; 癌基因; 抑癌基因; 遗传变异中图分类号: R737.35 文献标识码文章编号欧阳玲, 等. 应用比较基因组杂交技术研究外阴鳞癌组织的遗传变异院于 1996 年 5 月至 2004 年 12 月间活检及手术切除的外阴鳞癌患者 21 例, 年龄 35～84 岁, 中位年龄岁。所有患者术前未接受化学治疗及放射治疗术后均经病理证实为外阴鳞癌, 其中高分化 9 例中分化 7 例, 低分化 5 例; 国际妇产科联盟分期: Ⅰ期 11 例, Ⅱ期 7 例, Ⅲ期 3 例。CGH 分析中作为对照的正常 DNA 来自同一份健康女性供血者。所有标本均经液氮冷冻, - 70℃保存。

正常人外周血 DNA 的提取应用饱和 NaCl 法。应用缺口平移法标记 DNA 探针。肿瘤组织 DNA 和正常人 DNA 分别用偶联绿色荧光素脱氧尿苷三磷酸 (Spectrum Green dUTP) 和偶联红色荧光素的脱氧尿苷三磷酸标记。通过调整反应时间和酶的浓度, 使探针片段长度在 600～2000 bp。标记的待测及参照探针) 各 300 ng, 与 10 μg 人 Cot-I DNA 混均, 乙醇 2 次沉淀, 加入 2 μl TE(pH 8.0) , 基本溶解后再加入 8 μl 杂交液, 75℃水浴中变性℃预杂交 30 min。60℃烤片 2 h, 于 0.1 $g/μ酶抑制剂溶液中 37℃孵育 1 h, 2×SSC 摇洗乙醇梯度(70%、85%、100%) 脱水各 1 min, 气干于 73℃变性缓冲液中作用 5min, 乙醇梯度(70%、、100%) 脱水, 气干。将杂交混合液加于载玻片上的正常染色体区域, 盖好盖玻片, 置于湿盒中℃避光孵育 48 h。杂交后, 将染色体标本入 74℃的洗液 1(0.4×SSC/0.3% 去垢剂中洗 2 min, 常温的洗液 2(2×中洗 30 s, 避光气干。二氨基苯基吲哚复染加含有抗荧光淬灭剂的 50%甘油封片。荧光显微镜摄取每例外阴鳞癌标本的荧光染色体图像, 经德国 Laica 公司) 软件分析得到每例外阴鳞癌的分析图。计算每条染色体的绿、红荧光比值每例标本分析至少 5 个高质量的核型, 并将结果综合得出该标本整套染色体拷贝数扩增或丢失的全貌。判断标准 绿 /红比值≤0.8 为丢失, ≥为扩增。

结 果    外阴鳞癌组织中染色体的变异状态每份外阴鳞癌组织标本染色体均有不同程度的变异, 包括染色体全部或部分的扩增或丢失, 平均每例有 4.9 处异常区域, 其中丢失多于扩增, 分别为 2.6 处和 2.3 处。见表 1。外阴鳞癌组织中染色体扩增与丢失的分布特征出现 DNA 拷贝数增加的染色体分布特征为染色体 3q 部位, 其出现频率最高 43%; 其次为染色体 8q、12q 部位, 其出现频率分别为 38%和 33%。其相应的最小重叠区分别是 3q24-27, 8q12-24 和。出现 DNA 拷贝数丢失的染色体分布特征为: 染色体 4p、3p 部位, 其出现频率较高, 分别为和 43%, 其相应的最小重叠区分别是和 3p24( 表 1, 图 1) 。

讨 论    技术在外阴鳞癌研究中的应用技术是应用两种不同的荧光染料分别标记正常基因组 DNA 和肿瘤细胞 DNA, 制备成探表 1 21 例外阴鳞癌组织中染色体的变异情况图 1 病例 15 的 CGH 分析图针。两种探针等量混合后, 与正常 2 倍体中期染色体杂交, 通过检测染色体上两种荧光信号的相对强度比较, 判定肿瘤细胞 DNA 拷贝数的改变, 并同时在染色体上定位。以确定缺失或扩增基因的状态。

被检的材料来自于肿瘤细胞系, 实体瘤新鲜组织冰冻及石蜡包埋组织, 从中提取少量 DNA 即可进行全基因组检测。因此, 它是一种能够快速、全面分析染色体基因组, 甚至分析整条染色体扩增和丢失的分子细胞遗传学技术, 能够有效地分析肿瘤基因组遗传物质的不平衡状态。自 1992 年这一技术建立以来, 已广泛应用于肿瘤基因组不平衡性的检测, 结合其它分子细胞遗传学方法, 逐步地系统地克隆肿瘤相关基因, 将为肿瘤的病因学研究提供一条便捷有效的途径。外阴鳞癌的 CGH 分析起步很晚, 至今国内尚无报道, 国外仅有个别学者进行了研究报道, 其研究样本量也相对少。本研究应用技术对 21 例外阴鳞癌的染色体变异进行了分析。分析结果显示, 染色体 3q 部位的扩增率为特别是 3q24-27 区域的外阴鳞癌基因组明显扩增; 有学者报道外阴鳞癌染色体 3q 部位存在变异, 且均为高频率的扩增其它一些资料报道在宫颈癌、肛门癌等生殖道鳞癌中存在染色体 3q 部位的高频率扩增。本实验进一步说明了染色体 3q 部位的高频率扩增在外阴鳞癌的发生发展中发挥重要作用。本次实验数据及以往报道均提示染色体 3q 存在着一个或多个癌基因扩增, 这些癌基因在生殖道肿瘤的发生发展中起重要作用。

此外, 本研究还发现了染色体 12q 区域的较高频率的扩增, 以往仅 Yen 等在食管癌中有过报道, 可能这一区域存在一些尚未被发现的重要的与外阴鳞癌发生发展密切相关的癌基因, 相信进一步深层次的研究会为探讨外阴鳞癌发生发展的机制提供重要线索。本研究还发现, 染色体 8q 区域扩增率为特别是 8q21-23 区域的外阴鳞癌基因组明显扩增, 与 Allen 等报道的结果一致。提示染色体 8q21-23 区域扩增与外阴鳞癌发生发展有关; 该区域可能存在一些与外阴鳞癌发生发展密切相关的癌基因。Raitanen 等对 10 例外阴鳞癌细胞系的研究结果也支持这一观点。Kirchhoff 等于宫颈癌研究中也有同样报道。

染色体 4p、3p 的丢失在本研究中较常见, 其表达率分别为 52%和 43%, Allen 等和 Flowers 等欧阳玲, 等. 应用比较基因组杂交技术研究外阴鳞癌组织的遗传变异分别应用杂合性丢失(LOH) 及 CGH 方法研究外阴鳞癌中染色体 3p 的缺失, Jee 等报道外阴鳞癌中染色体 4p 的丢失, 均与本研究结果一致。结合本资料, 更进一步提示染色体 3p、4p 区域可能丢失了与外阴癌变密切相关的抑癌基因。本研究还发现外阴鳞癌 3 号染色体存在整臂的扩增与丢失, 推测在外阴鳞癌的发生中存在 3 号染色体高频率的着丝粒的断裂, 形成等臂染色体(isochromosome) , 并能够在随后的有丝分裂中不均衡的传给子代从而形成许多的等臂扩增和丢失。这与在宫颈癌中的报道一致, 并认为此种变化可能促进宫颈癌的进展。等臂染色体的形成及整臂染色体扩增和丢失在其它肿瘤中, 如在肝癌和乳腺癌等也得到证实说明外阴鳞癌的发生与演进过程可能与其它肿瘤存在共同规律, 可在今后的研究中互相借鉴。有意义的是, 结合以往的资料发现外阴鳞癌中染色体 3p、的丢失与其在宫颈癌中的变化非常相似提示外阴鳞癌与宫颈癌存在相似的致病方式、相同的遗传背景, 也进一步说明在染色体 3p、4p 部位存在与外阴鳞癌及宫颈癌发生发展密切相关的抑癌基因。