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摘 要：目的 通过检测大鼠骨髓来源的间充质干细胞对D-半乳糖致衰老大鼠免疫功能的影响，探讨间充质干细胞（MSCs）延缓衰老的作用。方法 选择清洁级SD大鼠，随机分为3组：正常对照组、衰老模型组、MSCs治疗组。衰老模型组和MSCs 治疗组每日皮下注射 D-半乳糖 400 mg/kg，连续注射 4 个月。MSCs 治疗组在衰老模型制备成功后，给予尾静脉输注3×106个MSCs，每周1次，连续4周。分别检测各组大鼠脾脏指数；MTT法检测脾脏淋巴细胞增殖活性；酶联免疫吸附（ELISA）法测定脾脏中IL-2和IL-10水平。并观察3组大鼠脾脏组织结构的差异。结果 间充质干细胞可增强衰老大鼠的细胞免疫功能。与衰老模型组相比，MSCs治疗组的脾脏指数显著提高，T淋巴细胞活性增强，同时脾脏IL-2表达水平明显升高；而IL-10的表达水平显著降低。与对照组相比，衰老模型组脾脏白髓比例相对较少，且白髓和红髓界限欠清晰；而MSCs组大鼠的脾脏损伤有明显修复。结论 MSCs可能通过提高细胞免疫功能来发挥其抗衰老作用，从而减轻D-半乳糖致衰老大鼠的脾脏损伤。

关键词：衰老；间充质干细胞；细胞免疫；白细胞介素-2；白细胞介素-10

衰老是生命过程中正常而又复杂的生理现象，是机体内各种生化反应的综合过程。随着年龄的增长, 自由基产生增多、而清除自由基的相关酶活性下降、机体免疫功能下降等多种因素均是机体发生衰老的重要机制。免疫系统作为一个完整自主的系统在维护和调整生命活动中起着重要作用，而免疫功能下降是衰老最突出的特征, 免疫功能失调又可加速机体的衰老［1］。D-半乳糖衰老动物模型自1991年被提出以来由于其造模方法简便易行，结果稳定，在国内得到广泛运用和发展［2-3］。

骨髓间充质干细胞(MSCs)是中胚层来源的具有多向分化能力的干细胞，在适当的诱导条件下, 不但可以向多种中胚层来源的组织细胞分化, 如分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞和肌母细胞等, 还可以跨系向多种细胞表型诱导分化，在体内迁移, 并可进行自体移植，因此越来越被视为治疗多种器官损伤疾病的良好途径［4］。本实验采用D-半乳糖致亚急性衰老的大鼠模型，观察MSCs对衰老大鼠的脾脏指数、脾淋巴细胞增殖转化能力及细胞因子等的影响,初步探讨了MSCs对D-半乳糖致衰老大鼠的抗衰老的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物与器材

1.1.1 实验动物 选用清洁级 SD 大鼠，共 30 只，雌雄各半，2~3月龄，体质量180~230 g。分笼饲养，随机分组。选用6~8周龄清洁级雄性SD大鼠20只，体质量130~150 g，用来提取骨髓间充质干细胞。实验动物由南方医科大学实验动物中心提供（动物编号SCXK 粤 2006-0015）。所有大鼠均单笼喂养，自由进食和饮用纯净水，实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准。

1.1.2 试剂与仪器 Thermo Formo 细胞孵箱，OLM-PUS 倒置显微镜，COULTER 流式细胞仪，Sigma 960全自动酶连分析仪（法国Meterteth）。低糖型DMEM( Gibco 公司)，胎牛血清(杭州四季青公司)，D-半乳糖（Sigma公司），大鼠IL-2及IL-10试剂盒（上海依科赛生物制品有限公司），刀豆蛋白A（ConA，晶美生物工程有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 大鼠骨髓来源的间充质干细胞的培养、鉴定①细胞培养：采用贴壁法培养大鼠骨髓来源的间充质干细胞。传代培养至第3代，倒置显微镜下观察MSCs形态并做HE染色；选取生长状态良好的第3代，以10个/cm2的细胞密度接种于6孔板内，2周后观察MSCs的克隆形成能力并做吉姆萨染色。

②细胞周期检测：分别取P3代生长状态良好的细胞，胰酶消化后制成1×105的细胞悬液，4℃预冷的体积分数为 0.7 的乙醇隔夜固定，预冷 PBS 漂洗离心。37℃的RNAsin处理30 min，离心，加入碘化丙0.5 ml，4℃避光染色30 min，流式细胞仪检测。

③细胞表面分子鉴定：取生长良好的P3代细胞，胰酶消化后，用磷酸盐缓冲液调整细胞量为2×105，制成4个样本，分别加入荧光标记单克隆抗体CD29，CD34，CD44，CD45，应用流式细胞仪检测细胞表面抗原表达，同时用小鼠IgG1-FITC 和IgG1-PE作为同型抗体对照。

1.2.2 D-半乳糖制备衰老动物模型及回输 MSCs 每日将D-半乳糖通过颈背部皮下注射给大鼠，剂量为400 mg/kg，连续注射 4 个月建立大鼠衰老模型。正常组不给予任何药物，正常饲养。D-半乳糖制作大鼠衰老模型的同时，治疗组大鼠用同种异体骨髓来源的MSCs治疗，尾静脉输注3×106个MSCs，每周一次，连续4周。正常组和模型组给予生理盐水。

MSCs 在大鼠脾脏内的分布：细胞生长到约 80%融合的P3代骨髓间充质干细胞，每瓶(25 cm2/ 瓶) 加入腺病毒(EGFP-CMV)上清液2 ml。不时缓慢晃动培养板，孵育3 h 后，补足正常培养基继续培养48 h，然 后 在 荧 光 显 微 镜 下 观 察 感 染 情 况［5］。 将GFP-MSCs 吹打成单细胞，计数。将 3×106个MSCs通过尾静脉输注给衰老模型大鼠，3 d后处死大鼠，取出脾脏组织制作冰冻切片，在荧光显微镜下观察。

1.2.3 脾脏指数的测定 动物称重后，颈椎脱臼处死。无菌解剖取胸腺和脾脏，无菌生理盐水洗去血迹，剪去脂肪及筋膜组织，用滤纸吸干，称质量，计算各组大鼠的脾脏指数的改变，单位mg/g体质量。脾脏指数=脾脏质量/大鼠重量×100%。

1.2.4 T 淋巴细胞转化实验 无菌取出脾脏，制备脾细胞悬液，调整细胞浓度为为1×106/ml，取 96 孔细胞培养板，每孔加脾细胞0.2 ml，ConA 15 μl (终浓度为6μg/ml)，每个样品均设 3 个复孔，以不加 ConA 为对照。加盖置入5% CO2，37℃条件下的培养箱中培养72 h。用 MTT 法测定脾脏 T 淋巴细胞增殖活性［6］，实验结果在酶标仪560 nm处读OD值。计算刺激指数（SI）= 实验孔A值/对照孔A值。

1.2.5 ELISA 法检测脾脏中细胞因子 IL-2，IL-10 的浓度 使用双抗体夹心ELISA法测定大鼠脾脏中IL-2和IL-10的含量，取脾脏组织匀浆液，以3000 r/min离心10 min，取上清-80℃保存。操作均按试剂盒说明书要求进行，实验结果在酶标仪450 nm处读OD值。

1.2.6 各组大鼠脾脏组织形态学观察 称重后的脾脏放入多聚甲醛液固定，常规石蜡包埋, 连续切片，苏木精-伊红染色后观察脾的组织结构。

1.3 统计学处理所有数据均以均数±标准差表示，采用SPSS13.0统计软件，以方差分析进行统计处理。P<0.05为差异有统计学意义。