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目前,检测Hp的方法很多[1],为了寻求一种简便易行的非侵入性检测方法,本文采用PCR技术、细菌培养、快速尿素酶试验、病理学检查4种方法,检测消化性疾病患者胃粘膜及口腔牙菌斑中的Hp,以探讨和比较这几种方法检测Hp感染的实用性和敏感性,为临床诊断Hp感染提供可靠的简便易行的检测手段。

1　材料和方法

1.1　临床资料:研究选取河北医科大学第四医院1997年10月~1998年5月,经胃镜检查确诊为慢性胃炎、消化性溃疡、胃癌患者共150例,其中男性88例,女性62例,年龄最大73岁,最小20岁,平均52.4岁。

1.2　检测方法[2]

1.2.1　标本采集:每位患者均同时采取牙菌斑和胃粘膜标本。

1.2.1.1　口腔牙菌斑:刷牙后至少8 h以上,在作胃镜前用无菌牙科刮治器在患者前磨牙和磨牙的龈上、龈下以及邻间隙内取牙菌斑(也可用牙线在患者牙齿的邻间隙中取),无牙颌患者采集义齿表面菌斑,用过的刮治器彻底清洗严格消毒,防止交叉感染。

1.2.1.2　胃粘膜:使用Olympus GIF-230电子胃镜在距幽门口5 cm内采集胃窦部活检标本2~4块,取出的组织用无菌小镊或消毒针移出。活检钳每次用后用2 %戊二醛或75 %酒精浸泡,使用前用无菌水或自来水冲洗干净,若活检钳沾有戊二醛则影响Hp检出率。

1.2.2标本处理

1.2.2.1　牙菌斑标本:分别将其1份立即放入快速尿素酶试纸中试验;1份放入细菌培养运输液中充分搅拌后,室温2 h内送至实验室培养;1份放入-4℃冰箱准备行PCR。

1.2.2.2　胃粘膜标本:1份立即行快速尿素酶试验;1份在室温下不超过2 h,将活检组织用无菌研磨器磨碎后,接种于布氏琼脂培养基中;1份标本送病理学检查;1份标本置-4℃冰箱内进行PCR试验。

1.2.3　检测Hp感染的实验方法与诊断标准

1.2.3.1　快速尿素酶试验(产品为珠海珠信生物制品开发有限公司出品):将患者牙菌斑、胃粘膜标本直接分别放在试纸上,根据指示标准,颜色变红,为Hp感染阳性,无变化则为阴性。

1.2.3.2　病理学检查:胃粘膜标本用10 %的福尔马林液固定,连续切片嗜银染色辩认Hp,镜下见细胞核和Hp着棕黑色,Hp呈小的短杆菌者,为Hp感染阳性,否则为阴性。

1.2.3.3　细菌培养:将牙菌斑、胃粘膜组织分别放置于小牛血清布氏肉汤运送培养基中送检,以布氏琼脂培养基为基础,加入脱纤维蛋白羊血及联合抗生素,3天后观察结果,选具有透明针尖样(直径1~2 mm)菌落涂片,革兰染色呈阴性,并做生化鉴定。

1.2.3.4　PCR检测方法:Hp-PCR试剂盒购于上海复星生物制品有限公司。PCR扩增仪为PERKINEELMER DNA热循环仪。标本处理、PCR扩增与检测均按试剂盒说明操作。为减少污染机会,DNA提取、PCR扩增及电泳分析分别在3个房间进行。

1.3　Hp感染诊断标准:胃粘膜经细菌培养、快速尿素酶试验、PCR技术、病理染色4种方法检测Hp,以细菌培养一项阳性和病理切片染色见到大量细菌者为Hp感染;病理切片染色(未见到大量细菌)快速尿素酶试验、PCR技术任两项阳性者为Hp感染。

以胃粘膜Hp感染为标准,分别统计PCR、尿素酶试验和细菌培养3种检测方法在口腔牙菌斑中对Hp感染的敏感性、特异性、预测值和准确度作出评价。

1.4　统计学分析:采用配对四格表资料的χ2检验。

2　结　　果

2.1　胃粘膜Hp感染检测结果:150例患者经PCR扩增阳性96例(64.0 %);病理染色阳性89例(59.3 %);快速尿素酶试验阳性77例(51.3 %);随机选取36例患者行细菌培养,阳性15例(41.5%)。根据Hp感染的诊断标准,共检出87例Hp感染者。PCR方法与其它3种方法相比(表1、2),PCR方法与尿素酶试验和细菌培养结果比较差异有显著性(P<0.05),而与病理学染色差异无显著性(P>0.05)。

2.2　口腔牙菌斑Hp感染检测评价结果:150例患者应用PCR技术、快速尿素酶试验进行牙菌斑中Hp检测,并随机选取36例进行细菌培养。36例患者3种检测方法结果显示:PCR检测Hp阳性17例(47.2 %);细菌培养阳性13例(36.1 %);快速尿素酶试验阳性17例,其中2例为假阳性,快速尿素酶试验实际检出率为41.6 %。13例细菌培养Hp阳性者,PCR方法Hp均为阳性;4例PCR阳性而培养阴性者中3例培养为大量霉菌生长;17例快速尿素酶试验阳性中,15例PCR方法Hp阳性,2例阴性,经培养证实为变形杆菌引起的尿素酶假阳性,而PCR阳性,尿素酶阴性2例。以胃粘膜活检标本为诊断Hp感染标准,对上述3种方法在口腔牙菌斑中Hp感染进行诊断实验的评价(表3)。可见应用PCR技术检测口腔牙菌斑中Hp,其敏感性、特异性、准确度和予测值较细菌培养和快速尿素酶两种方法均优越。

2.3　不同方法检测口腔牙菌斑及胃粘膜Hp感染比较:36例患者细菌培养结果显示,细菌培养检测口腔牙菌斑和胃粘膜中Hp感染,两者差异无显著性(P>0.05)。91例患者尿素酶试验结果显示,尿素酶方法检测口腔牙菌斑和胃粘膜中Hp感染,两者差异无显著性(P>0.05)。71例患者应用PCR技术检测口腔牙菌斑和胃粘膜中Hp感染者差异无显著性(P>0.05)(表4)。

3　讨　　论

Hp在人群中感染率很高,迫切需要一种有效、安全、特异性强、灵敏度高、无创伤性的诊断法,但至今没有一种既简便又敏感的诊断方法。目前依取材不同将Hp感染的临床诊断分为两类:①无创伤性检查:包括血清学方法,同位素标记尿素的呼气试验和胃液PCR等.血清学方法由于血清抗体水平的消长需一定时间,Hp感染初期,抗体尚未升高,Hp被根除之后,仍可在体内维持一定时间,所以该法不能反应Hp感染现象;呼气试验需一套贵重仪器,操作复杂,尚不能作为临床常规检查方法,抽取胃液也使患者感到恶心和不适。②创伤性检查均为胃镜依赖方法,为患者带来很大痛苦和不便。