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患酮病、脂肪肝时,由于能量负平衡而发生低血糖,胰岛素分泌减少,使胰岛素与高血糖素比例下降,启动脂肪动员机制以缓解能量负平衡[1]。胰岛素、胰高血糖素是维持血糖平衡的重要激素,胰岛素能够加速葡萄糖的利用和抑制葡萄糖的生成,使血糖降低;胰高血糖素通过刺激糖原分解和糖异生增加肝脏葡萄糖的产生,使血糖升高;瘦素参与肝脏内糖及脂肪代谢,刺激肝糖产生,同时通过对肝脏磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶及糖异生的影响,限制甘油三酯的合成,提高肝脏及外周组织对胰岛素的敏感性。而胰高血糖素的这种生物学作用又是通过结合到肝细胞膜上特异的胰高血糖素受体实现的。胞膜上受体数量一方面处于不断合成与降解的动态平衡中,另一方面又受各种生理或病理因素的影响而发生变化[2]。

已知代谢产物NEFA通过降低靶组织细胞的胰岛素受体数量抑制胰岛素与受体的结合[3],使胰岛素的生物学功能不能得到正常发挥;同样,任何导致靶组织细胞GLNR数量改变的因素都会影响GLN功能的实现。但有关神经内分泌因子In、GLN、和代谢产物NEFA、BHBA、GLU对奶牛GLNR的影响目前未见报道。本实验通过测定神经内分泌因子In、GLN、和代谢产物NEFA、BHBA、GLU对体外培养肝细胞丰度的影响,来探讨酮病、脂肪肝时神经内分泌因子和代谢产物对GLNR数量的影响以及胰高血糖素对奶牛肝脏糖代谢、脂代谢的调控作用,旨在从分子水平揭示酮病、脂肪肝的发病机理,为防治奶牛酮病、脂肪肝的发生提供理论依据。

主要试剂　胶原酶Ⅳ、RPMI1640、D-Hank’s平衡盐溶液、反转录酶AMV、RNase Inhibitor、Oligo(dT)、ExTaq DNA聚合酶、dNTPs、DNA Marker Ladder 2000购自Takara公司;焦磷酸二乙酯(DEPC)、胰岛素、胰高血糖素、瘦素、β-羟丁酸、油酸购自Sigma公司;Trizol RNA提取试剂购自Invitrogen公司;琼脂糖为Promega公司产品。葡萄糖、氯仿、异戊醇、无水乙醇等试剂均为国产分析纯。

仪器设备　RNA/DNA calculator(Pharmacia Biotech公司);PCR仪UNⅡ型(Biometra公司);7930型高速冷冻台式离心机(HITACH公司);倒置显微镜(上海光学仪器有限公司型荧光定量PCR扩增仪(美国ABI公司培养箱(日本SANYO电子仪器有限公司)。

肝细胞采集及单层原代培养　选取临床检查无异常的未哺乳的新生1日龄犊牛,颈动脉放血致死后,无菌条件下剪取肝后叶组织,去除肝表面结缔组织和肝内大血管,D-Hank’s平衡盐溶液冲洗2~3次,用眼科剪刀剪碎组织块至1 mm3左右,放入50 mL离心管中加入适量D-Hank’s平衡盐溶液离心5~10 min,洗涤2~3次,弃上清,去除血细胞、细胞碎片及其他杂质,加入5~10 mL 0·25%胶原酶Ⅳ消化液和等量的D-Hank’s平衡盐溶液,37℃水浴消化40 min,其间每隔摇动离心管1次,之后加入等量含10%小牛血清的培养液终止消化,800~1 000 r/min离心5~10 min,洗涤细胞2次,去除胶原酶,分散细胞和组织,将悬液通过100目尼龙网滤器,收集细胞,充分分散细胞后计数,按每孔106个细胞接种到已包被了多聚赖氨酸的6孔板,37℃、5% CO2培养箱中培养,4 h细胞贴壁后,换无血清培养液,以后每隔12 h换液1次,培养3 d后,添加神经内分泌因子和代谢产物。

·4　引物和探针设计　根据GenBank胰高血糖素受体序列设计荧光定量PCR引物和探针,上下游引物分别为: 5’

5　单层原代培养肝细胞GLNR mRNA丰度的测定试验研究的培养液,直接在培养板的每个孔中加入1 mL的Trizol液,室温静置3 min后,用移液管吹洗裂解液几次,转移裂解液于一·5 mL离心管中,然后按Trizol试剂盒说明操作提取肝细胞总。取5μL总RNA用1%甲醛变性琼脂糖凝胶进行电泳检测,判断RNA的完整性。总RNA做20倍稀释后采用Pharmacia Biotech公司的RNA/DNA calculator,在下测定RNA的纯度及浓度,选择吸光度比值·8的总RNA,用DEPC-H2O将所有样品的总的浓度调节一致,以消除提取RNA过程中的总RNA含量的差异,确保定量的精确性。根据测定的纯度及浓度调整总RNA的体积,使各反转录体系总的量相同。cDNA合成按试剂盒说明操作,20μL反应体系如下:调整浓度后的总RNA 5μL,Oligo(dT)185μL,10×μL,dNTP Mixture(各2·5mM)2μ·5μL,AMV 2μL, DEPC处理水1·5μL;反应条件为:70℃变性5 min,0℃退火5 min,42℃逆转录90 min,95℃AMV失活℃冷却5 min。

20μL反应体系如下:cDNA 1·0μL,上游引物(12 pmol/μL)1·0μL,下游引物(12 pmol/μL)1·0μL,dNTP Mixture(各2·5 mM)2·0μ×RT Buffer 2·5μL,ExTaq DNA聚合酶(1 u/μL)0·3μL,探针μL)1·0μL,灭菌水16·2μL;反应条件为:94℃预变性℃变性15 s,58℃退火30 s,72℃延伸40 s。数据用SPSS10·0软件进行统计,差异显著用方差分析,进行Duncan’sLSD检验。体外培养肝细胞总RNA电泳图谱　将提取的肝细胞总于1%甲醛变性琼脂糖凝胶进行电泳,结果显示,出现了明显、完整的3条带(见图1),分别为28S、18S和5S,RNA没有降解,完全符合反转录要求。A260/A280值均大于1·8,达到了实验的纯度要求。GLNR mRNA荧光定量标准曲线　以阳性标准品模板拷贝数的对数为横坐标,循环域值(cycle threshold,Ct)为纵坐标绘制GLNR mRNA丰度的荧光定量标准曲线(见图2)。标准曲线的Slope值(PCR扩增效率标志,Slope值为3时扩增效率为100%)为:-3·348 123。

不同浓度神经内分泌因子和代谢产物处理的体外培养肝细胞GLNR mRNA丰度的荧光定量结果图2　GLNR mRNA荧光定量PCR标准曲线原代培养肝细胞中GLNR mRNA的拷贝数可通过Ct值与标准曲线对应得到,通过ABI PRISM 7000荧光定量PCR仪匹配计算机应用程序分析得出定量结果。随细胞培养液中In、NEFA、BHBA和GLU浓度的增加,肝细胞中GLNR mRNA拷贝数不断增加(见表1和3)。肝细胞拷贝数在各添加量与对照组间差异极显著·01),各剂量之间也差异极显著(P<0·01)。随细胞培养液中GLN浓度的增加,肝细胞拷贝数不断减少(见表1)。肝细胞GLNR mRNA拷贝数在各添加量与对照组间差异极显著(P<0·01),各剂量之间也差异极显著(P<0·01)。随细胞培养液中瘦素浓度的增加,肝细胞中拷贝数先不断增加而后降低(见表2)。肝细胞拷贝数在各添加量与对照组间差异极显著(P<0·01),各剂量之间也差异极显著(P<0·01)。