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蒺藜皂苷(GSTT)是蒺藜的有效成分,主要包括螺甾醇和呋甾醇两类。研究发现,GSTT具有降血压,调血脂,降血糖,抗动脉粥样硬化,阻止动脉、心肌和肝脏的脂质沉着,改善血液流变学指标,抗缺氧,抗衰老和增强性功能,舒张血管,抗心肌缺血再灌注损伤及脑缺血再灌损伤等作用[1-4]。目前对其的研究多在预适应方面,其对缺血后处理的作用尚未见报道。本研究旨在观察在体情况下,再灌注同时ip GSTT进行药物后处理,探讨其对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用,为临床治疗心肌缺血再灌注损伤提供理论依据。

1　材料与方法

1·1　药品、试剂与仪器:蒺藜皂苷(GSTT)由吉林敖东洮南药业股份有限公司提供,质量分数>90%; 乌拉坦,中国医药集团上海化学试剂公司;尼可地尔,购自长春大政国际经贸集团制药有限公司;乳酸脱氢酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛 (MDA)检测试剂盒,均购自南京建成生物工程研究所;肿瘤坏死因子-α(TNF-α)及白细胞介素-6 (IL-6)试剂盒(R&D,200908)。TECAN A—5082 酶标仪,Austria;恒温水浴箱,北京医疗设备厂; 6010—紫外分光光度计,安捷伦上海分析仪器厂; LDZ4—1·8型低速自动平衡离心机,北京雷勃尔离心机有限公司。

1·2　动物:清洁级Wistar大鼠,体质量200~220 g,雌雄兼用,由吉林大学白求恩医学院实验动物中心提供,合格证号:SCXK (吉) 2007-0003。

1·3　模型制备:Wistar大鼠,以20%乌拉坦(5 mL/kg) ip麻醉,仰卧位固定,切开气管,用动物呼吸机机械通气,参数为:呼吸频率75次/min,潮气量9 mL/kg,呼吸比1∶2。四肢皮下接心电图机, 稳定5 min后,记录一段正常心电图作为对照。于胸骨左侧2 mm切开皮肤,在第四肋间隙用眼科剪向下分离肋间肌,向上伸入血管钳夹闭两侧肋间肌以减少出血。剪断3、4肋骨,用拉钩拉开胸壁,在两侧胸壁肌肉分别穿一双线留小圈在内侧。小心剪开心包膜,暴露心脏。以左冠状静脉主干为标志,在左心耳下缘3~4 mm处以缝合针进针,斜向右上方肺动脉圆锥方向出针。待呼吸平稳10 min后收紧结扎线,压迫左冠状动脉前降支。冠状动脉结扎30 min 后轻拉松结扎线,恢复血液灌注。分别在正常状态下,穿线及结扎后测量心电图,以确定模型成立。

1·4　实验分组:56只大鼠随机分成7组,每组8 只,分别为假手术组:冠状动脉下穿线不结扎,缺血再灌注模型组:缺血30 min,再灌120 min,缺血后处理组:缺血30 min,再灌30 s,缺血30 s,反复3 次,再灌120 min,GSTT (100、30、10 mg/kg)组: 缺血30 min,再灌120 min,再灌起始时分别ip GSTT 100、30、10 mg/kg,尼可地尔组:缺血30 min,再灌 120 min,再灌起始时ip尼可地尔1 mg/kg。

1·5　血清生化指标测定:于再灌注结束时经腹主动脉取血,3 000 r/min离心10 min,分离血清。按试剂盒说明书采用分光光度法检测血清MDA、LDH 水平及SOD活性。

1·6　TNF-α与IL-6的测定:于再灌注结束时经腹主动脉取血,3 000 r/min离心10 min,分离血清,按 ELISA试剂盒说明书检测血清TNF-α与IL-6水平。

1·7　病理组织切片测定:再灌注结束后迅速摘取心脏,置于4%多聚甲醛中固定过夜。心尖上约3 mm处纵向切取左室心肌约0·3 cm×0.5 cm。进行常规石蜡包埋,切片,染色,梯度乙醇脱水,二甲苯透明,中性树脂封片,光镜观察。

1·8　心肌组织凋亡检测(TUNEL法):心肌组织切片常规脱蜡水化,按试剂盒操作说明进行 TUNEL染色,成色反应后,常规脱水,二甲苯透明, 中性树胶封片。光镜下观察细胞核中有棕黄色颗粒者为TUNEL阳性细胞,在400×显微镜下,于缺血处心肌组织随机采集5个非重叠视野,检测100个心肌细胞中TUNEL阳性细胞数,取其平均值。

1·9　统计分析:实验结果以x±s表示,采用SPSS 10·0统计软件对实验数据进行方差分析。

2　结果

2·1　对血清生化指标的影响:与假手术组比较,模型组血清MDA、LDH水平明显升高,SOD活性明显降低(P<0·01);与模型组比较,GSTT 100、30 mg/kg和缺血后处理组血清MDA、LDH水平降低,SOD活性明显升高(P<0·05、0·01)。结果见表1。

2·2　对TNF-α与IL-6水平的影响:与假手术组比较,缺血再灌注大鼠血清中TNF-α与IL-6水平明显升高。对心肌组织病理形态学的影响:光镜下观察, 假手术组心肌纤维排列整齐,结构清楚,横纹清晰可见,细胞核呈长椭圆形,分布均匀,心肌细胞无肥大、萎缩或水肿;模型组心肌细胞间隙增宽,心肌纤维明显肿胀,排列紊乱,可见部分肌纤维断裂,心肌细胞间可见大量散在的红细胞和部分成片红细胞渗出, ·1327·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs　第41卷第8期2010年8月心肌间质出现大量炎细胞浸润,可见肌浆凝聚;缺血后处理组及GSTT 100、30 mg/kg组心肌细胞排列相对规则,界限清楚,心肌纤维轻度肿胀,红细胞明显少于模型组,偶见成纤维细胞及炎细胞浸润;阳性对照药尼可地尔组偶见肌浆凝聚,炎细胞浸润不明显。

2·4　对心肌细胞凋亡的影响:光镜下观察细胞核中有棕黄色颗粒者为阳性细胞,假手术组可见少量凋亡细胞,说明正常细胞存在凋亡,但凋亡率小于 10%。与假手术组比较,模型组TUNEL染色阳性细胞数明显增多(P<0·01);与模型组比较,GSTT 100、30 mg/kg组、后处理组和阳性药组TUNEL 染色阳性细胞数明显减少(P<0·05、0·01)。

3　讨论　　心肌缺血性疾病是目前临床上发生率最高的急症之一,进行血运重建可显著降低其死亡率,但潜在的再灌注损伤可能会引起心肌细胞坏死、凋亡、心肌顿抑及无复流现象,成为影响预后的一个重要因素。研究显示[5-6],在闭塞的冠脉血管完全开放、心肌组织实现完全再灌注之前,间断少许开放冠脉血流,直至最后完全的开放血流,对于再灌注损伤具有干预作用,心肌组织可以得到一定的保护,即缺血后处理具有保护作用。与缺血预适应相比,缺血后处理在实施上有更好的可预测性及可控性,因此具有较好的临床应用前景[7]。尽管这种机械后处理是一种新的治疗理念和手段,但具有潜在的危险,临床应用有限。经过探索发现[8-9],在完全恢复血流前,不采用机械后处理办法,而使用模拟内源性保护机制的药物———即药物后处理(pharmacological post-conditioning),对心肌缺血再灌注损伤具有类似缺血后处理的保护作用, 可避免反复机械刺激导致的严重问题。 GSTT为临床上常用的抗心脑血管疾病药物, 本实验室的前期研究发现,GSTT预适应对心肌缺血再灌注损伤具有保护作用[10],故本实验进一步探讨GSTT后处理对缺血再灌注损伤是否具有保护作用。