分子标记具有高度专一性、特异性、灵敏性和准确性，目前已被广泛地运用到各种作物的遗传多样性、纯度和真实性鉴定等方面[1-15]。在众多标记中，SSR（Simplesequencerepeats）标记的优越性更为明显。在相关研究中，寻求一套在遗传上多态性高、稳定性强和重复性好的核心引物可以达到事半功倍的效果。目前，已经有多种作物涉及到核心引物的研究，其中玉米的相关研究[1-3]开展较早且技术体系较为完善，现已确定一套适于玉米杂交种纯度鉴定的核心SSR引物。油菜中，李海渤等[4]利用100份具有代表性的油菜品种（系）为材料，对746对SSR引物进行筛选，确定44对甘蓝型油菜核心引物。在棉花上，目前CMD（Cottonmicrosatellitedatabase）网站和CottonDB(Cottongenomedatabase)公布的SSR引物有一万多对，根据研究者的目的不同，在引物的选择和利用方面也不同。潘兆娥等[5]选用12份表型性状和遗传差异较大的棉花种质作为参比种质，对来自CMD网站的5914对棉花SSR引物进行了筛选，推荐其中319对作为棉花种质资源鉴定和分子指纹分析的核心引物。王俊芳等[6-7]用21份基础种质资源为材料，从409对引物中筛选出扩增带型稳定、多态性较高、且分辨能力强的核心引物25对；以18份陆地棉和3份海岛棉品种为材料，从78对棉花SSR引物中筛选出55对具有多态性的引物，并确定33对棉种鉴定用的备选核心引物。刘峰等[8]以32份审定棉花品种为材料，共筛选2000对引物，获得26对多态性核心引物，其中11对引物被推荐为棉花品种鉴定的首选核心引物。匡猛等[9]以32份棉花主栽品种为材料，共筛选引物214对，获得36对核心引物。以上研究中，多使用差异较大的不同品种或资源为筛选材料，主要针对不同棉种或者常规品种，而针对陆地棉杂交种的核心引物尚无系统研究。本研究的目的是从大量的SSR引物中筛选出一批多态性高、可重复性好、适用性强的针对棉花杂交种的核心引物，并对核心引物的信息含量及质量高低进行评价，为棉花杂交种的指纹图谱建立、纯度和真实性鉴定等研究提供理论依据。

1材料和方法

1.1材料以2008年长江流域棉区区试的42份棉花杂交种为引物筛选材料，编号分别为A01～A11、B01～B11、C01～C10和D01～D10（材料来源：国家长江流域棉花杂交种区试华中农业大学抗病鉴定点，由区试统一供种）。生产上大面积推广的37个棉花杂交种（黄河流域棉区17个和长江流域棉区20个）作为核心引物验证材料，由选育单位提供，品种名称和来源见表1。

1.2方法

1.2.1DNA提取及PCR扩增凝胶电泳。用改良的CTAB法[10]提取棉花总DNA。2300对SSR引物来自CMD网站，由三博远志公司合成。SSR-PCR反应体系、PCR扩增程序、PAGE凝胶电泳及显色方法参照本实验室的吴茂清等[11]方法进行。

1.2.2分子标记数据统计与分析。对凝胶上清晰可见且有差异的谱带进行记录，按分子量从大到小的顺序记带，有带记“1”，无带记“0”，计算位点多态信息含量PIC，PIC=1-ni=1ΣPi2，其中Pi为某引物扩增的第i个等位基因出现的频率[12]。采用类平均法(UPGMA,Unweightedpair-groupmethodwitharithmeticmeans)对相似系数矩阵和遗传距离矩阵进行聚类分析。相似系数和聚类分析均由NTSYS-PCV2.1软件完成。

2结果与分析

2.1核心引物的初步筛选利用2008年长江流域棉花区试A组的11个杂交种以及华杂棉H318对2300对SSR引物进行初步筛选，筛选标准为多态性明显且扩增带型清晰。共获得多态性引物251对，占总引物数量的10.9%。对初次筛选出的251对引物，又以2008年长江流域棉区区试的42个杂交种进行复筛，复筛标准为扩增带型与初筛结果差异小，带型清晰，多次扩增结果均表现稳定的多态性。共获得引物80对，占复筛引物数量的31.9%，占总引物数量的3.5%。上述结果表明，以棉花杂交种为材料，筛选得到可用引物的比例很低。

2.2核心引物的确定以近几年黄河流域棉区审定的17个和长江流域棉区审定的20个棉花杂交种为材料，对筛选出的80对SSR引物进一步筛选和验证。综合考虑多态性和杂合率两个指标，最终获得56对多态性稳定的引物，占复筛引物总数的70%，占总引物数量的2.4%。56对核心引物共涉及NAU，BNL，CIR，HAU，GH，DPL，JES，MGHES，MUSS等9个系列，每个系列所获得的引物占筛选引物的比例变幅在1%～5%，平均筛选比例仅为2.9%。56对核心引物均匀分散在A、D组的不同染色体或连锁群上，它们所反映的多态性信息含量在0.1928～0.7887，其中有38对引物在0.49以上。

2.3核心引物评价

2.3.1核心引物的代表性。本实验引物确定经过了严格而又合理的筛选过程，遵循“择优选取”的原则。为保证引物的鉴定效率，以稳定性高、可重复性好作为确定引物的首要标准。利用56对引物对37个品种进行扩增，有2个品种有2对特异引物，10对引物通过组合的方式可以将37个验证品种完全区分开，可以推荐作为推广品种纯度和真实性鉴定的首选核心引物。它们分别是BNL3140，BNL3646，BNL3650，BNL4069，CIR194，CIR249，DPL489，HAU250，NAU3377，NAU5120，这10对引物所反映的多态性信息含量集中在0.4990到0.7482之间。对56对引物在37个品种中扩增结果进行统计：共检测到95个多态性位点，变幅为1～3个，共检测到161个基因型，变幅为2～3个，该套引物的多态性信息含量不高，但它们在37个推广品种中表现出稳定的多态性，完全达到了区分不同品种的要求。图1为引物NAU3254在37个推广杂交种中的多态性扩增图谱，多态性扩增条带稳定、清晰，这表明该引物具有很好的代表性。

3.3.2核心引物的实用性。以棉花杂交种华杂棉H318的亲本及杂种一代为模板，利用筛选到的56对核心引物进行PCR扩增，电泳结果表明：在亲本及杂种间无多态性表现的引物为13对，占23.2%；有多态性表现的引物为43对，占76.8%。其中表现共显性条带的引物为5对，占11.6%。共显性引物的比例完全满足杂交种真实性和纯度鉴定的需要。图2显示共显性引物HAU2937在华杂棉H318亲本及杂种一代中的电泳带型图。从56对核心引物中随机挑选出10对核心引物分别对华杂棉H318、鄂杂棉10号、C111三个杂交种F1的100个个体进行多态性评价，结果表明10对核心引物在3个杂交种群体中具有各自稳定的多态性带型，完全可以满足杂交种纯度鉴定的要求（表2）。

2.4核心引物的有效性利用筛选出的56对核心引物对目前生产上大面积推广的37个杂交种的遗传多样性进行检测，根据56对引物的读带记录，利用Ntsys-2软件进行聚类分析，获得了37个品种的聚类图（图3）。在相似系数为0.54时，20个长江流域棉花杂交种中有19个被划分到第一类，17个黄河流域棉花杂交种中有11个被划分到第二类。结果表明，目前我国不同生态区域的棉花品种在选育过程中，由于同一生态棉区的育种目标相近，亲本材料的选用方面有较大的遗传相似性或者说利用的骨干亲本来源的遗传差异相对较小，而局限性较大。如鲁棉研38、鲁棉研15、鲁棉研24、鲁棉研30、鲁棉研25、鲁棉研39六个杂交种由山东棉花研究中心培育，在相似系数0.63的水平上聚在一起。华杂棉H318和华杂4号在相似性系数约为0.77的水平上聚在一起，这两个杂交种具有相同的母本材料B11；中棉所57和中棉所77在相似系数约为0.81的水平上聚在一起，而两者具有相同的母本材料中棉所41。这表明了核心引物的扩增结果可以准确地反映品种之间的亲缘关系。也有某些品种在母本或父本相同的遗传背景下，并没有在一个比较高的遗传相似系数水平上聚在一起。如鄂杂棉10号、鄂杂棉11号和鄂杂棉13号，中棉所57、中棉所75和中棉所77。推测原因：一是由于棉花杂交种具有巨大的商业价值，其亲本材料一般不予公开，至少亲本之一是以代号的形式出现，有一定的不确定性；二是由于棉花属于常异花授粉作物，一般有1%～5%的异交率，高则达20%以上。亲本在繁殖的过程中如不采取隔离措施，可能发生异交导致后代分离。如亲本提纯标准不同，那么来自同一品种的不同后代单株所衍生出的系统可能有较大的遗传上的差异。

3讨论

在对棉花已有的相关研究中，多以常规棉品种或常规棉和少数棉花杂交种同时作为核心引物的筛选材料。由于常规品种和杂交品种类型不同，它们的遗传基础各异，在分子水平上差异明显。本试验完全以棉花杂交种为材料，通过对2300对SSR随机引物进行多态性初步筛选、复选，最终获得56对带型清晰、稳定，重复性好的多态性引物，占总引物数量的3.5%，其中有340对是从已报道的文献中获取的多态性引物，在杂交品种中表现出多态性的占4.4%，筛选结果发现获得多态性引物的比例都很低。潘兆娥等[5]、王俊芳等[6-7]以及匡猛等[9]最终获得的核心引物与初筛引物比例分别为5.4%，6.1%，42.3%，16.8%，这比我们利用棉花杂交种为核心引物为筛选对象的结果2.4%要高；而刘峰等[8]1.3%的结果比我们的结果低。理论上，棉花杂交种个体间基因型相同，但个体内基因型则高度杂合，即每一个体内至少综合了2个亲本的遗传物质；另外，在杂种优势利用组合的亲本选配原则上，通常以生产上大面积推广且配合力好的材料作为亲本配置出的组合优势更强。由于在亲本的选择上有一定局限性，使得同一生态棉区或同一育种单位的育种家在培育棉花杂交种的过程中，对其中某一亲本选配上可能相同，而导致杂种的遗传相似增大，这些遗传上的差异都可能导致引物多态性的下降。由于棉花杂交种间的多态性低，不易检测到，为获得尽量多的可供选择的核心引物，我们在初选引物时没有限定引物类型，这与相关文献中挑选均匀分布于染色体上或者单位点引物的方法不同[4,6]。另外，筛选的标准更偏向于引物多态性的代表性和稳定性。筛选过程中两类引物被淘汰，一是在个别品种中体现特异性的引物，在多数品种中不能体现多态性；二是在少数品种中表现高多态性的引物，但带型稳定性较差，如引物GH499初筛时有5个多态性位点，但没有进入复筛。利用核心引物组合法比特征谱带法更适用于构建中国棉花主栽品种DNA指纹图谱和纯度鉴定[9]。刘峰等[8]的相关研究表明，核心引物理论上可区分的最大品种数即为每个核心引物检测到基因型数的乘积值。本实验中每对引物可以检测到的基因型数目变幅为2～3，10对随机挑选的核心引物可鉴定最大品种数目为1024～59049个，56对核心引物可鉴定品种数目为7.2×1016～5.2×1026，完全可以满足品种鉴定的需要。我们利用56对核心引物对来自不同棉区的37个生产上推广的杂交品种进行遗传相似性鉴定，分析了品种间在分子水平上的差异，其结果与亲本来源基本吻合。同时看出，同一育种单位育成的部分品种间遗传距离较近，不同地区和不同育种单位育成的品种间遗传距离相对较大，这一结果与相关研究结果相似[8-9]。通过利用其中10对引物对华杂棉H318、鄂杂棉10号、C111三个杂交种F1的纯度鉴定，分子标记鉴定结果与田间形态鉴定结果一致。表明通过以杂交种为对象，从大量的随机引物中筛选出的核心引物用于棉花杂交种的纯度和真实性检测以及DNA指纹图谱的构建具有针对性、可靠性等特点，同时可为相关研究者提供信息，减轻前期大量的引物筛选工作量。

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