本文作者：陆征宇 赵虹 汪涛 陈洁 宗蕾 单位：上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院

帕金森病（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎｄｉｓｅａｓｅ，ＰＤ）是发生于中老年人的黑质和黑质－纹状体通路变性的疾病，以黑质多巴胺能神经元变性缺失和路易小体形成为病理特征，临床表现为进行性运动徐缓、肌强直及震颤等症状。ＰＤ的发病率随着年龄增长而升高，我国６５岁以上老年人ＰＤ患病率约为１．７％［１］，随着人口的老龄化，患者逐渐增多。实验研究显示针刺“百会”“风府”“阳陵泉”等穴位，对帕金森病模型小鼠纹状体多巴胺等神经递质具有一定的调节作用［２］。本研究以Ｃ５７／ＢＬ雄性小鼠为实验动物，探讨针刺“百会”“风府”“阳陵泉”对ＰＤ小鼠自主活动、爬杆、游泳等行为和纹状体神经元凋亡的影响，从而为临床研究提供进一步的实验依据。

１材料与方法

１．１动物与分组雄性８周龄Ｃ５７／ＢＬ小鼠２８只，体质量２０～２５ｇ，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，动物许可证号：ＳＣＸＫ（沪）２００７－０００５，清洁级动物饲养室喂养，自由饮水取食。将小鼠随机分为正常组、模型组、针刺组和西药组，每组７只。

１．２主要试剂及仪器１－甲基－４－苯基－１，２，３，６－四氢吡啶（ＭＰＴＰ，Ｓｉｇ－ｍａ公司），多巴丝肼（上海罗氏制药有限公司）。ＭＩＱＡＳ医学图像定量分析系统、医学图像定量分析软件、ＢＨ２生物显微镜（日本ＯＬＹＭＰＵＳ）、４５００数码相机（ＮＩＫＯＮ）、ＨＩＳＴＯＳＴＡＴ－８２０切片机（ＲＭＣ），华佗牌无菌针灸针（０．２５ｍｍ×２５ｍｍ，苏州医疗用品厂有限公司），Ｇ６８０５－２型电针仪（上海医用电子仪器厂）。

１．３造模方法参照文献［３］腹腔注射ＭＰＴＰ复制ＰＤ小鼠模型。用生理盐水溶解ＭＰＴＰ配制成３ｍｇ／ｍＬ溶液，小鼠适应环境１０ｄ后开始造模，其中模型组、针刺组、西药组按３０ｍｇ／ｋｇ腹腔注射ＭＰＴＰ，每日１次，连续注射７ｄ。正常组腹腔注射等量生理盐水，每日１次，连续注射７ｄ。

１．４各组处理方法模型复制后，各组动物分别给予相应的治疗，每日１次，治疗１４ｄ。正常组、模型组给予生理盐水（０．１ｍＬ／１０ｇ）灌胃。针刺组针刺“百会”“风府”“阳陵泉”穴，针刺后双侧“阳陵泉”接Ｇ６８０５－２型电针仪，连续波，频率为２Ｈｚ，电流强度１ｍＡ，刺激１５ｍｉｎ。西药组将多巴丝肼配制成相当于临床等效剂量１０倍的水溶液，即２．５ｍｇ／ｍＬ溶液，给予灌胃（０．１ｍＬ／１０ｇ）。小鼠在最后一次相应处理后禁食、禁水，次日断头处死，１ｍｉｎ内开颅取出全脑，在冰盘上准确分离取出纹状体组织，进行组织包埋。

１．５观察指标及检测方法

１．５．１行为学检测分别在造模前、造模后、治疗后对小鼠进行以下行为学检测。（１）自主活动计数：自制３０ｃｍ×３０ｃｍ×１５ｃｍ有机玻璃盒，底部刻出６ｃｍ×６ｃｍ的格子，在安静、光线较暗的环境中测试。小鼠适应环境１０ｍｉｎ后，计算５ｍｉｎ内在玻璃盒底部移动的格子数，连续测５次取平均值。（２）爬杆实验：用一直径１３ｍｍ、高７６０ｍｍ的光滑不锈钢杆，垂直竖立，将小鼠头向下放置在金属杆的顶部，使其沿杆自然爬下，观察小鼠在下行过程中的行为，对其进行评分。爬杆实验评分标准：０分，四肢并用，一次顺利从杆上爬下；０．５分，一步一步螺旋向下爬行，但兼有后肢滑行行为；１分，上杆后停顿数次后爬下，但可抱紧金属杆；１．５分，滑行后滑落，伴轻微震颤；２分，频繁性震颤，四肢僵直，不能抓杆，直接掉落；２．５分，小鼠出现连续震颤，四肢麻痹，不能活动或死亡。（３）游泳实验：将受试小鼠放入一个２０ｃｍ×３０ｃｍ×２０ｃｍ的有机玻璃水箱中，水深１０ｃｍ，水温为２２～２５℃，进行１ｍｉｎ游泳实验。游泳实验评分标准：３分，１ｍｉｎ内连续不断游泳；２．５分，大部分时间游泳仅偶尔飘浮；２分，漂浮时间占整个受试时间５０％以上；１．５分，偶尔游泳；１分，偶尔用后肢游泳并漂浮在水箱一边；０．５分，出现连续震颤，四肢麻痹，不能活动或死亡。

１．５．２纹状体神经元凋亡检测采用ＴＵＮＥＬ检测法。（１）组织包埋及切片：纹状体组织浸入含２．５％戊二醛的固定液中，４℃保存待测；用０．１ｍｏｌ／Ｌ的ＰＢＳ（ｐＨ７．２～７．４）洗涤１次；１％锇酸固定液固定１ｈ；以丙酮梯度脱水，将组织置于丙酮与环氧树脂（Ｅｐｏｎ８２）混合比为１∶１的混合液中浸泡３０ｍｉｎ后，再用纯Ｅｐｏｎ８２浸泡２ｈ；平板包埋，定位，超薄切片，醋酸铀和柠檬酸铅染色。（２）指标检测：二甲苯６０℃脱蜡２次，每次５ｍｉｎ；依次经１００％、９５％、９０％、８０％、７０％乙醇水合；ＰＢＳ漂洗２次；加入１００μＬ蛋白酶Ｋ工作液（２μＬ５０×蛋白酶Ｋ＋９８μＬＰＢＳ），２１～３７℃反应１５～３０ｍｉｎ；ＰＢＳ漂洗２次；滴加新鲜配制的５０μＬＴｄＴ酶反应液（４５μＬＥｑｕｉｌｉｂｒａｔｉｏｎＢｕｆｆｅｒ＋１μＬＦＩＴＣ－１２－ｄＵＴＰ＋４μＬＴｄＴ酶），加盖玻片３７℃避光湿润反应６０ｍｉｎ；ＰＢＳ漂洗３次；荧光显微镜检测，激发波长４５０～５００ｎｍ，发射波长５１５～５６５ｎｍ（绿）；滴加５０μＬ工作液（４０μＬＰＢＳ＋１０μＬａｎｔｉ－ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎａｎｔｉｂｏｄｙ），加盖玻片３７℃湿润避光反应３０ｍｉｎ；ＰＢＳ漂洗３次；滴加新鲜配制的１００μＬＤＡＢ工作液（５μＬ２０×ＤＡＢ＋１μＬ３０％Ｈ２Ｏ２＋９４μＬＰＢＳ），室温显色反应１０ｍｉｎ；ＰＢＳ漂洗３次，贴片，晾干，苏木素复染，乙醇梯度脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。光学显微镜下观察，图像定量分析仪定量拍照（显微镜倍数×２５０，电压３．４７Ｖ，电流２．２５Ａ，视野总面积０．０３４ｍｍ２）。每个样本取３个视野，分别计算出凋亡指数。

２结果

２．１自主活动计数各组小鼠造模前自主活动计数比较，差异均无统计学意义（Ｐ＞０．０５）。模型组小鼠造模后及治疗后自主活动计数显著低于同时点正常组（Ｐ＜０．０１）。针刺组治疗后自主活动计数显著高于模型组（Ｐ＜０．０５）；西药组治疗后自主活动计数显著高于模型组（Ｐ＜０．０１），与针刺组疗效相当（Ｐ＞０．０５）。见图１。（ＡＩ），３个视野的ＡＩ平均值即为该样本的ＡＩ，ＡＩ＝阳性细胞数／总细胞数。１．６统计学处理采用ＳｉｇｍａＳｔａｔ

２．２爬杆实验各组小鼠造模前爬杆实验评分比较，差异无统计学意义（Ｐ＞０．０５）。模型组小鼠造模后及治疗后爬杆实验评分显著高于正常组（Ｐ＜０．０１）。针刺组小鼠治疗后爬杆实验评分显著低于模型组（Ｐ＜０．０５）；西药组治疗后爬杆实验评分显著低于模型组（Ｐ＜０．０５），与针刺组疗效相当（Ｐ＞０．０５）。见图２。

２．３游泳实验各组小鼠造模前游泳实验评分比较，差异无统计学意义（Ｐ＞０．０５）。模型组小鼠造模后及治疗后游泳实验评分显著低于正常组（Ｐ＜０．０１）。针刺组小鼠治疗后游泳实验评分显著高于模型组（Ｐ＜０．０５）；西药组小鼠治疗后游泳实验评分显著高于模型组（Ｐ＜０．０１），与针刺组疗效相当。

２．４纹状体神经元凋亡光镜下可见正常组小鼠纹状体神经元呈淡蓝色，圆形且形态饱满；模型组、针刺组和西药组小鼠纹状体神经元数量较正常组明显减少，其形态不完整，大多呈破碎状；ＴＵＮＥＬ染色阳性细胞呈深棕色，形态不规则，染色不均匀，部分视野可见呈点状的增生胶质细胞。模型组、针刺组、西药组神经元凋亡指数均显著高于正常组（Ｐ＜０．０１），针刺组凋亡指数显著低于模型组（Ｐ＜０．０１），西药组与模型组凋亡指数差异无统计学意义（Ｐ＞０．０５）。见图４。

３讨论

统计分析软件进行统计分析。各组数据以均数±标准差（ｘ珚±ｓ）表示，采用单因素方差分析并以Ｎｅｗｍａｎ－Ｋｅｕｌｓ检验（ｑ检验）做组间比较，统计检验均采用双侧检验，Ｐ＜０．０５为差异具有统计学意义。ＰＤ是常见病，临床症状包括自主运动减少、运动迟缓、肌张力增高、静止性震颤、慌张步态、面具脸、屈曲姿势和平衡障碍等。目前国际神经科学界一致认为ＰＤ治疗的理想目标是控制症状，提高生活质量，延缓病程进展，延长控制症状药物使用的年限，减少药物的不良反应和并发症。近年来各项研究不断揭示针灸治疗ＰＤ具有广阔的前景，实验研究结果提示针灸治疗可以提高ＰＤ动物模型黑质多巴胺能神经元数量及纹状体多巴胺能神经纤维密度，使黑质和纹状体区胶质细胞系源性神经营养因子及其ｍＲＮＡ、功能性受体Ｒｅｔ表达增强，能够增强黑质神经营养因子蛋白表达水平，显著降低黑质细胞凋亡率，对黑质－纹状体系统多巴胺能神经元、脑线粒体具有保护作用［４－９］；对多项临床研究进行Ｍｅｔａ分析显示针灸治疗ＰＤ安全、有效［１０］，具有重要的临床研究意义［１１］。用ＭＰＴＰ所建立的ＰＤ小鼠模型是目前较为理想的动物模型［１２］。ＭＰＴＰ本身并无毒性，其进入体内在胶质细胞单胺氧化酶Ｂ等作用下转化为甲基－苯基吡啶离子，后者被多巴胺转运体摄取到多巴胺能神经元胞体内，抑制线粒体呼吸链复合体Ⅰ的活性，使自由基生成增加，同时甲基－苯基吡啶离子还可以使细胞内乳酸堆积、Ｃａ２＋平衡紊乱、一氧化氮合成增加、谷胱甘肽合成减少，从而加剧自由基的过度生成，降低细胞对自由基损伤的抵抗能力，最终导致多巴胺能神经元凋亡，产生临床症状。自主活动计数、爬杆实验、游泳实验等［１３－１６］是ＰＤ动物模型最常用的行为学检测方法，对运动减少、运动迟缓、运动协调障碍等症状具有较好的检测效果。研究证实ＭＰＴＰ可以导致小鼠出现与人类ＰＤ患者类似的运动障碍。腹腔注射ＭＰＴＰ造模后，小鼠出现了震颤、肢体强直、运动迟缓、步态不稳等症状，行为学病变程度明显加重。本研究发现，ＭＰＴＰ造模后模型组、针刺组、西药组小鼠自主活动计数显著下降，爬杆实验评分显著升高，游泳实验评分显著下降；经针刺和多巴丝肼治疗后ＰＤ小鼠的运动能力均有所提高，且针刺组纹状体神经元凋亡指数显著低于模型组。综上所述，针刺“百会”“风府”“阳陵泉”可改善ＰＤ小鼠自主活动、爬杆、游泳等行为，减少纹状体神经元凋亡，改善ＰＤ的运动症状。

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