本文作者：胡砚平 刘冰 苏彤 程筠 赵炜 杨海东 单位：厦门市口腔医院颌面外科 武汉大学口腔医院颌面外科中南大学湘雅医院颌面外科

舌癌是口腔颌面部最常见的恶性肿瘤，尽管近年来舌癌采用以手术为主的综合治疗，疗效不断提高［1］，但复发率仍然较高，而且舌癌术后复发对患者的预后有明显的不良影响［2］。对影响舌癌复发的因素进行研究，并对其复发的可能性作出预测，为临床采用较激进的方案进行治疗提供依据，对舌癌的治疗意义重大。目前对舌癌术后复发的影响因素的研究多偏重于临床因素和病理因素，但这些因素的分析对舌癌复发的预测效果欠佳。IL-8是一种主要由中性粒细胞产生的强有力的中性粒细胞趋化因子和活化因子［3］，能促进大鼠角膜中血管形成和诱导兔角膜囊模型产生新的血管，可促进某些恶性肿瘤的血管新生、生长和转移。在IL-8的启动子区251位点存在着单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism，SNP)，本研究检测舌癌组织中IL-8-251的SNP，并分析其SNP与复发的关系，为预测舌癌的复发提供依据。

1资料与方法

1．1病例资料收集2006～2008年间厦门市口腔医院颌面外科、武汉大学口腔医院颌面外科、中南大学湘雅医院口腔颌面外科初次住院治疗的舌癌患者173例，均经病理诊断证实，其中31例失访，实际纳入人数142人，随访时间从12个月到36个月不等，平均23个月。142例中男73例，女69例，年龄最大82岁，最小26岁，平均45岁。患者的临床资料均由病历采集，详见表1。治疗方法为2例局部扩大病灶切除+舌骨上清扫，51例局部扩大病灶切除+肩胛舌骨上清扫，89例局部扩大病灶切除+根治性或改良根治性颈淋巴清扫术。术前行VM方案化疗15例，术后行PVP方案化疗52例，术后放疗48例。TNM分期根据国际抗癌联盟的标准区分，复发定义为局部复发和淋巴结转移，均经病理诊断证实。

1．2方法IL-8的表达采用SABC免疫组化法测定，IL-8多克隆抗体和SABC试剂盒均购自武汉博士德生物试剂有限公司，SABC免疫组化的操作步骤按说明进行，抗体的工作浓度为1∶50。11例来自舌部脉管瘤患者切除术后修整切缘时的多余舌组织用做对照。IL-8-251位点的SNP检测采用高分辨率溶解法(high-resolutionmelting，HRM)，步骤为蛋白酶K法提取舌癌组织DNA，定量至10ng/μl，按IL-8-251的基因库号(Gen-BankAF3856283470)设计正向和反向引物5'-CATCCATGATCTTGTTC-3'和5'-AAATACGGAGTATGACGA-3'。PCR步骤为:95℃5min预变性，然后95℃5s，60℃10s，72℃25s，共50个循环，再进行高分辨率溶解，步骤为95℃1min，40℃1min，65℃1s，LightCyclerRed640-标记的锚探针为5-TTATCATAGTACCATGTGACAGATATAGTACTAGAGTGGC-3。然后运行genescanning程序，得到杂合子A/T和纯合子的分型图谱，由于HRM分型不能将野生纯合型及突变纯合型分开，将其中的部分样本测序后(测序结果为T/T)，再将其渗入其余的纯合型样本中，得到A/A和T/T的分型图，三种基因型均测序以验证HRM结果。空腹状态下抽取医院实习生30人的静脉血各3ml，加至含有1．5g/L乙二胺四乙酸钠(EDTA-Na2)的抗凝管中，于低温冰箱保存，用作正常人IL-8-251SNP的对照。采用SPSS10．0软件，舌癌患者和对照组间IL-8-251基因型的比较分析、IL-8的多态性与临床病理特点的关系分析、舌癌复发的单因素分析采用卡方检验，舌癌复发的多因素分析采用Logistic回归分析，P＜0．05表示差异具有显著性。为方便分析，T分期将T1和T2分为一组，T3和T4分为一组，N分期分N0和N1+2，分化状态中，高分化为一组，中低分化分为一组。

2结果

142例患者中52例复发，其中IL-8阳性者45例，阴性者7例，复发的时间最短为术后3个月，最长为术后35个月。IL-8在76．7%(109例)的病例中呈阳性表达，表达部位在上皮层和癌巢(图1)，在23．3%(33例)的病例中呈阴性表达，正常的舌组织IL-8呈阴性表达(图2)。IL-8-2513种基因型的频率在舌癌患者中分别为AA14．8%(16例)、AT47．2%(51例)、TT38%(42例)，在对照组中为AA16．7%(5例)、AT46．7%(14例)、TT36．6%(11例)，2组人群之间IL-8-251AA、AT和TT3种基因型差异无显著性，图3～7为IL-8-251SNP在舌癌患者中的分型图和测序图。复发病例中IL-8-251AA型11例(68．8%)，AT型21例(41．2%)，TT型13例(31%)。分析IL-8-251基因型与临床病理的关系发现，IL-8-251基因型与性别、年龄、T分期、N分期、分化状态无关，IL-8-251AA型病例组包括更多的舌癌复发患者，与IL-8-251AT和TT组相比差异有显著性(P=0．04)，单因素分析发现IL-8-251AA型与舌癌的复发有关(表2、3)。多因素分析发现IL-8T-251AA型的优势比(OR)为3．34，95%的可信区间为1．15-10．94(P=0．03)。

3讨论

血管生成在肿瘤发展和预后中起着十分重要的作用，血管生成过程可由许多生长因子所触发，这些生长因子是肿瘤细胞和(或)其周围的基质细胞分泌的［4］。IL-8可诱导内皮细胞的迁移和增生来介导肿瘤组织血管增生，从而促进肿瘤的发生［5－7］。激活血管内皮细胞表面的IL-8受体，促进血管生成［8］，说明IL-8是一种强有力的血管发生因子，能促进肿瘤血管生长。IL-8的表达不仅与舌癌的微血管生成有关，而且与舌鳞癌患者的临床分期密切相关，在舌鳞癌的进展和转移中发挥重要作用［9］。本研究发现IL-8在舌癌组织中高表达，阳性表达率为76．7%，IL-8阳性表达者比阴性表达者更容易复发，因此对IL-8阳性的舌癌患者可采取更激进的治疗，当然，这点尚需大样本的进一步研究。SNP是人类基因组中广泛存在的一类遗传变异，主要表现为单个核苷酸的置换，基因调控序列中的SNPs可影响基因表达水平［10］。IL-8在启动子区域的251位点存在A/T的SNP，研究表明IL-8-251的SNP与IL-8的产物有关，在A/A，A/T及T/T3种基因型中A/A促血管生成的能力最强［11］。本研究采用高分辨率溶解检测正常人血清和舌癌患者组织中IL-8-251SNP的情况，发现在正常人和舌癌患者间IL-8-251SNP并无差异，提示IL-8-251位点的单核苷酸多态性与舌癌的发生没有关系。有研究表明IL-8-251A/T的多态性会增加胃癌、乳腺癌等的风险［12］，本研究并不支持这一观点，但发现IL-8-251A/A与舌癌复发有关。在本组病例中，IL-8阳性的患者251A/A型的复发率为68．8%，AT型为41．2%，TT型13为31%，差异有显著性，IL-8-251A/A的患者有更高的复发倾向，这有待大样本的进一步研究确认。在对非小细胞肺癌［13］和鼻咽癌［14］的研究中，也发现IL-8-251A/A的患者更易复发，而且淋巴结转移的患者更多，本研究未对局部和颈部复发分开进行分析，但值得注意的是，本组病例单独行局部复发的单因素分析时发现与T分期无关，但结合局部复发和颈部转移时发现与T分期有关。目前对舌癌术后复发的影响因素的研究多偏重于临床因素和病理因素，对舌癌复发的分子标记物方面的研究罕见，导致对其复发预测的困难，寻找分子标记物来预测舌癌的复发对舌癌患者有重要意义。本研究对IL-8-251A/T的多态性与舌癌复发的关系进行观察，发现IL-8-251A/A与舌癌复发有关，检测IL-8-251的多态性，对IL-8-251A/A的患者采取更激进的治疗方法，或采用个体化治疗，对降低舌癌的复发率会有积极的作用。

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