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【关键词】　酶联免疫吸附测定;　免疫印迹法;　实验室技术和方法

酶联免疫斑点检测技术(ELISPOT)结合了细胞培养技术与酶联免疫吸附试验(ELISA)的长处,能够分析经特异抗原活化后分泌细胞因子[如γ干扰素(IFN-γ)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)等]的单个效应细胞的频数,具有敏感、特异、易于重复的优点。ELISPOT是检测抗原反应性效应细胞的最可靠实验方法之一[1],目前已成为抗原特异性T细胞免疫学研究的主流技术。本文对ELISPOT技术作如下综述。

1　ELISPOT的基本原理

ELISPOT的培养板以聚偏二氟乙烯(PVDF)膜等为基质,包被上特异性单克隆抗体,在培养板孔内加入细胞培养基、待检测的细胞及抗原刺激物进行培养。在特异性抗原或非特异性有丝分裂原的刺激下,T细胞分泌各种细胞因子,细胞因子被膜上的单克隆抗体捕获。被捕获的细胞因子可以与生物素标记的第二抗体结合,然后用酶标亲和素与生物素进行化学酶联显色,在膜的局部形成一个个圆形斑点[2]。

2　ELISPOT的优点

ELISPOT得到广泛应用首先是由于其在检测抗原特异性细胞低频数时的高敏感性,比以流式细胞术为基础的技术(四聚体和细胞内细胞因子染色)的敏感性要高出1~2个数量级。

其次,ELISPOT可以利用冻存的外周血单(个)核细胞(PB-MC)样本来进行免疫监测分析而不丧失细胞的重要活性[3],同时计算机辅助图像分析系统的使用也使大规模研究成为可能。各种ELISPOT分析方法由于IFN-γ分泌量较多,且与T细胞的细胞毒功能密切相关,一直以来IFN-γELISPOT分析得到了广泛应用。但是单纯检测IFN-γ不足以充分反映T细胞的免疫功能,从而检测多种细胞因子成为需求,相应出现了双色ELISPOT、荧光ELISPOT、Granzyme B ELISPOT等分析方法。但这些方法还需进一步完善,虽然早已出现了双色ELISPOT应用的报道,但一些原因却限制了其广泛使用。首先,当ELISPOT板包被时,两种捕获抗体竞争结合到膜表面,因为抗体的疏水性决定了它们结合到膜上的亲活力,如果一种抗体更加亲水性,它将丧失竞争力;其次,底物产生的两种颜色必须各自独立形成,它们之间不能相互干扰,两种颜色任何一种都不能处于优势地位,这样产生两种细胞因子的细胞才能被检测出来;图像分析系统也必须建立起来并通过验证能准确、客观地测量每个斑点的颜色和形态。此外,细胞因子的产量还受反馈机制调节,因此需要明确哪些细胞因子结合可以在双色ELISPOT中进行检测,Quast等[4]发现IL-2可导致IFN-γ和IL-5斑点的丢失。

荧光ELISPOT检测时由于荧光素直接耦联在抗体或者亲和素上,缺乏酶催化底物的放大作用,灵敏度无法和化学显色的ELISPOT方法比较。此外,硝酸纤维素膜和PVDF膜有自发荧光现象,能引起背景升高,信噪比下降[5]。

4　ELISPOT标准化与验证

由于超高的灵敏度,ELISPOT结果易受到诸多因素影响,所以需要进行ELISPOT的标准化和验证[6]。

4.1　ELISPOT的标准化

4.1.1　ELISPOT板　Shaw等首先将PVDF膜应用到ELIS-POT,后来随着ELISPOT IP、HP以及HTS板材的应用,质量得到进一步的提高[7]。塑料ELISA板蛋白结合能力有限,所以不建议使用。建议一项研究中使用同一种板材,最好为同一批次,同时需要检查生产厂家的质量控制程序、批次性能以及是否达到生物分子筛查协会制定的标准。

4.1.2　包被规程　使用PVDF膜板,建议预湿时每孔加入15μL的70%乙醇来降低膜的疏水性。但乙醇必须被充分洗掉,残留乙醇能干扰斑点形成。抗体对的选择根据实验要求而定,需要考虑抗体敏感性等因素。不同商品试剂盒检测相同细胞因子的敏感性可相差10倍,所以需要进行标准化,其中的一个重要参数是包被抗体的总量,一般认为每孔约0.5~1.0μg包被抗体可以得到理想的斑点。

4.1.3　细胞准备　(1)细胞分离:因为红细胞溶血和血小板分泌的抑制因子能影响T细胞功能,所以必须进行外周血单个核细胞的分离。(2)冻存、贮藏和运输:冻存在细胞处理过程中最关键。细胞的冻存有几种方法,自动控制降温器可以提供逐步智能降温,这在细胞最佳冻存及其标准化程序中是必需的,经济实用的方法是使用装有异丙醇的冻存盒。血液样本处理、分离及冻存的最佳时间范围应该在8 h内或者在采集当天完成,样本放置时间过长或在不合适的温度下过久,会影响PB-MC的功能,甚至可造成IFN-γ斑点形成细胞减少5倍以上。

运输PBMC的最佳方式是专用的冷冻液氮装置,液氮缓慢挥发使气态氮充满运输容器,从而使样本可在接近-140°的恒定温度下保持10~18 d。不断变化的温度会对细胞功能造成致命影响,不推荐用干冰运输盒运送标本。(3)细胞复苏:细胞复苏时应用DNA酶能提高细胞的产量并降低细胞团块形成[8]。ELISPOT分析前最好将PBMC放置过夜,使有凋亡倾向的细胞死亡,这样在分析前就可以估计出活力细胞的确切计数。

4.1.4　刺激抗原　重组蛋白可以用来检测CD4+T细胞介导的反应,对CD8+T细胞介导的反应有限。对重组蛋白的反应依赖于抗原呈递细胞(APCs),APCs在冻存后数量减少,同时重组蛋白在不同贮藏温度下会出现溶解性和稳定性的问题。活的重组病毒载体或病毒感染细胞株也有相似的优缺点。重叠多肽池能用来鉴定CD4+和CD8+T细胞识别的最佳表位。

肽段越短,重叠越多,鉴别组织相容性复合物(MHC)-Ⅰ表位时越精确,而不需要考虑可能的MHC-Ⅱ类反应,因为MHC-Ⅱ表位的氨基酸序列长度相对要长。所以检测MHC-Ⅰ表位(CD8+T细胞反应)、MHC-Ⅱ表位(CD4+T细胞反应)时在考虑合成肽价格的同时需要找到一个理想的平衡点。另外,使用多肽时需要注意多肽的纯度,以降低非特异细胞因子的产生。

4.1.5　细胞计数　ELISPOT在细胞数量上需要很高的准确性,同时,减少死亡细胞的影响也很重要,死亡细胞可影响分析的正确性。常用台盼蓝排斥试验和对丝裂原的反应来判断复苏后PBMCs的质量。但Smith等[9]的实验表明,检测细胞凋亡在判断细胞活力方面更有效,当凋亡小于18%时可以得到理想结果。目前已有自动化设备用来进行细胞计数和活力检测。

4.1.6　洗涤及斑点形成　洗涤程序可以手工也可以使用自动洗板机,大批量洗涤时手工需要很长时间,从而造成孵育时间不一致。另外,手工清洗时如果缓冲液过少或压力过低均不能完全移除细胞和试剂,从而造成膜上的假相斑点增多以及孔的周边颜料聚集。因此,建议使用自动洗板机,一般要求至少可以使用两种不同的清洗缓冲液,同时能调整清洗探针的高度和缓冲液的流量。斑点的形成规程与ELISA规程相似,正确的抗体及其浓度必须通过实验验证后加以选择,最佳抗体量需要参考生产厂商的要求。对于亲和素酶复合物也必须给予重视,批间的酶变异性要很小,以保证实验的可比性。底物的选择能够影响斑点的检测数量,同一种酶的不同底物以及不同厂商生产的同一底物可能在敏感性上不同,从而造成斑点计数产生相当大的区别[10]。